二化螟β1微管蛋白基因cDNA序列的克隆与序列分析

微管是真核生物体内分布最为广泛的一类蛋白,是由a-和β-两种不同的微管蛋白组成的异源二聚体.微管参与许多细胞功能,如细胞形态发生、细胞生长和分裂等.以二化螟3龄幼虫为材料提取总RNA,利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(RACE),扩增得到该虫的β微管蛋白基因的cDNA序列一条.cDNA序列含1 862个碱基,开放读码框1 344个碱基,编码氨基酸447个,分子量约为50.2kD,等电点4.82.氨基酸序列中1～4个氨基酸MREI为β微管蛋白转录后调控信号,是微管蛋白特异片段;氨基酸序列的140～146GGGTGSG位存在一个微管蛋白标志信号片段.序列比对表明,克隆的β微管蛋白基因与其他昆虫的β微管蛋白基因在核苷酸和氨基酸水平上都是高度同源的,与家蚕Bombyx moriβ1微管蛋白的氨基酸序列同源性达到99.1%,与烟草天蛾β1微管蛋白的氨基酸序列同源性达到98.7%,与果蝇Drosophila melanogasterβ1微管蛋白的氨基酸序列同源性达到96.9%.该基因cDNA序列已经登录Genbank并获得登录号为EU429675.     

光皮桦ACC氧化酶基因BlACO的克隆和表达分析

ACC（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid）氧化酶（ACO）是植物乙烯合成过程中的关键限速酶,对乙烯的合成具有重要的调控作用。以光皮桦茎叶组织提取的RNA为模板,据已报道的ACO同源序列设计简并引物,通过RT-PCR扩增获得部分基因片段,结合5＇,3＇RACE方法从光皮桦中扩增出1个ACO的全长cDNA序列。该基因cDNA全长1262bp,具有一个957bp的完整开放阅读框架,编码含318个氨基酸的蛋白。与其他植物中的ACO基因进行同源性比对的结果显示,BlACO蛋白与欧洲白桦的同源性最高,达到97%。该基因在光皮桦的雄花和雌花中表达量较高,而在茎中的表达量较低。     

燕麦β-1,3-葡聚糖酶Ⅱ基因 3'端cDNA的克隆及分析

实验利用3＇-RACE技术进行燕麦β-1,3-葡聚糖酶Ⅱ（Oglc13Ⅱ）3＇末端cDNA的快速扩增并进行序列分析.将0.01%的HgCl2诱导处理24h之后的燕麦（Avena Sativa）幼叶作为材料,利用RT-PCR技术得到Oglc13Ⅱ的部分cDNA片段,根据此片 段设计一条特异性上游引物,反转录引物中的部分序列即3＇sites Adaptor Primer作为下游引物,按3＇RACE试剂盒（Takara）操作流程进行Oglc13Ⅱ3＇末端cDN A的快速扩增,成功获取837bp的3＇-RACE反应产物,通过BLAST技术,发现该片段与 许多植物β-1,3-葡聚糖酶基因具有较高的相似性（50.0%～72.0%）.因此认为成功 克隆了Oglc13ⅡcDNA的3＇末端序列.     

西伯利亚蓼钙调蛋白基因的克隆及其在盐胁迫下的表达

已从西伯利亚蓼叶中cDNA文库中获得的钙调蛋白EST序列,采用cDNA末端快速扩增（RACE）技术克隆了具有完整编码区的钙调蛋白基因的cDNA序列（GenBank登录号GQ988382）,命名为PsCaM。该基因全长615bp,编码区为450bp,编码149个氨基酸,5＇非翻译区为63bp,3＇非翻译区为102bp。同源性分析表明,该蛋白与其他植物钙调蛋白高度保守,氨基酸同源性高达98%。用实时荧光定量PCR研究3%NaHCO3胁迫下西伯利亚蓼基因表达的结果显示,自然条件下,该基因在叶中表达量最高,地下茎次之,茎中最低;盐胁迫下CaM在西伯利亚蓼的地下茎、茎和叶中均有表达,表达模式不同。     

巴西橡胶树的脂酰辅酶A还原酶cDNA克隆及其序列分析

从巴西橡胶树差减cDNA文库中筛选到一个与脂酰辅酶A还原酶同源性较高的基因片段,根据该基因片段序列信息,设计特异引物,采用RACE进行差异片段的5’和3’端的扩增,获得长度为1365bp的cDNA克隆R28（GenBank登陆号：AY461413）。序列分析表明,该基因包含1149bp的开放阅读框,5＇-UTR为96bp,3＇-UTR为128bp,编码382个氨基酸,推测其蛋白质的分子量为43．5kDa,等电点为8．97,有一个跨膜螺旋N（187至215位氨基酸）和1个由17个氨基酸组成的信号肽（1至17位氨基酸）。R28含有脂酰辅酶A还原酶的保守（NADP结合蛋白保守区）,推测该基因是一个脂酰辅酶A还原酶基因。     

三种鳞翅目夜蛾科昆虫α-微管蛋白基因的克隆与mRNA表达水平

根据昆虫微管蛋白的分子特征筛选对昆虫微管有效的抑制剂来控制昆虫的生长发育或不同器官的有效功能的表达来达到控制害虫的目的,在未来的害虫综合治理中具有广泛的应用前景。以预蛹期甜菜夜蛾Spodoptera exigua、小地老虎Agrotis ypsilon和八字地老虎Agrotis c-nigrum为材料提取总RNA,利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(RACE),分别扩增得到以上3种夜蛾科昆虫的α-微管蛋白基因的cDNA序列,3种昆虫的该基因序列均包括1个1353个碱基的开放阅读框。这3个cDNA序列均编码1个含450个氨基酸的蛋白,分子量约为50kDa。氨基酸的142~148位存在1个微管蛋白信号片段GGGTGSG,在氨基酸序列的C-端都有1个酪氨酸残基,N-端存在1个对转录后调控非常重要的保守区MRECI序列,以上特点与其他昆虫α-微管蛋白氨基酸序列保守区序列相同。序列比对表明,克隆得到的α-微管蛋白基因的核苷酸序列是高度保守的,同源性为94.4%~97.0%,而氨基酸的序列同源性达到100%。利用RT-PCR技术在3种昆虫4龄、5龄、6龄幼虫、蛹期4个不同发育阶段和6龄期的肠道、体壁、脂肪体3种不同组织中都检测到了α-微管蛋白基因在mRNA水平的表达。     

费尔干猪毛菜病程相关蛋白基因（SfPR-1）的克隆及在盐胁迫下的表达分析

利用抑制消减杂交法从藜科猪毛菜属盐生植物费尔干猪毛菜（Salsola ferganica）中分离得到了一个盐胁迫响应的cDNA片段,结合SMARTTMRACE技术获得了费尔干猪毛菜病程相关蛋白基因的cDNA,命名该基因为SfPR-1（GenBank登录号：JQ670917）。序列分析表明,SfPR-1长817 bp,含有501 bp的阅读框、65 bp的5＇-UTR和251 bp的3＇-UTR,编码166个氨基酸,分子质量为18.01 kD,理论等电点为9.37。通过BLAST同源序列比对分析,结果显示该基因编码的蛋白与已知甜菜、拟南芥、烟草及玉米的病程相关蛋白PR-1同源性分别为73.6%、57.8%、55.5%和53.9%,且具有PR-1家族特有的6个半胱氨酸保守结构域。半定量RT-PCR和实时荧光定量RT-qPCR分析表明,该基因在盐胁迫后表达呈明显上调,初步推测病程相关蛋白基因SfPR-1可能与费尔干猪毛菜的耐盐性相关。     

稻瘟菌侵染诱导水稻凝集素基因的表达

利用mRNA差异显示技术（DDRT-PCR）,从非亲和性稻瘟菌生理小种131侵染的水稻品种爱知旭（Oryza sati-vaL.cv.Aichi-asahi)叶片中分离了8个诱导差异表达的cDNA片段,对这8个差示片段进行了回收,重扩增和克隆,以其中一个长度为321碱基并与甘露糖结合水稻凝集素和水稻盐诱导蛋白基因高度同源的差示片段为探针。筛选水稻非亲和性cDNA文库,获得12个阳性克隆。序列测定和数据库查询表明该基因的cDNA与水稻凝集素基因的cDNA及盐诱导蛋白基因的cDNA核苷酸同源笥高达96%。推定的氨基酸序列与甘露糖结合水稻凝集素的氨基酸序列一致。与水稻盐诱导蛋白仅相差2个氨基酸。Southern杂交显示该基因在水稻基因组中有两个同源拷贝数。Northern杂交表明非亲和性稻瘟菌侵染可强烈诱导该基因表达。因此推则该基因参与了水稻对稻瘟菌侵染的防御反应。     

光皮桦中4-香豆酸辅酶A连接酶基因B14CL的克隆和表达分析

以从光皮桦茎叶组织提取的mRNA为模板,根据其他已克隆到的阔叶类树种中4-香豆酸辅酶A连接酶（4CL）基因的同源序列设计兼并引物,进行RT—PCR扩增,获得部分基因片段,然后结合5’,3’RACE方法从光皮桦中扩增出1个4CL基因的全长cDNA序列,命名为B14CL。该基因cDNA全长为1983bp（GenBank登录号FJ410448）,具有完整的开放阅读框架（69—1697bp）,编码蛋白为542个氨基酸,包含一个AMP结合功能域和一个含有12个氨基酸的功能基序。与其他植物中的4CL进行同源性比对的结果显示,B14CL蛋白与东北白桦的同源性最高,达到了98％。该基因在光皮桦的根和茎中表达量较高,而在花和叶中的表达量低。     

‘津田’芜菁Transparent Testa Glabra 1（BrTTG1）基因的克隆及表达分析

TTG1（Transparent Testa Glabra 1）蛋白是一种WD40类蛋白,参与植物的生长和发育。采用RT-PCR方法从芜菁品种‘津田＇中克隆了BrTTG1 cDNA序列（GenBank登录号HM208590）。该基因cDNA开放阅读框长度为1 014 bp,编码一个由337个氨基酸残基组成的蛋白,该蛋白分子量为37.28 kDa,理论等电点为4.66。与其他植物中的TTG1蛋白进行同源性比对结果显示,BrTTG1与甘蓝型油菜的TTG1同源性最高。BrTTG1蛋白在31～337位氨基酸处含有WD40超家族的保守结构域。荧光定量PCR检测BrTTG1在‘津田＇芜菁不同组织中的表达结果表明,该基因在有花青素合成的红色‘津田＇芜菁根皮中表达量最高。     

巴西橡胶树顺式异戊烯基转移酶基因cDNA克隆及其序列特征分析

以巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)胶乳的RNA为Tester;叶片RNA为Driver,利用抑制消减杂交法(suppressive subtractive hybridization,SSH)构建了一个胶乳特异表达基因差减文库.通过反式Northern点杂交(reverse Northern dot blots)筛选到一个与顺式异戊烯基转移酶基因(橡胶生物合成的关键酶基因)高度同源的阳性克隆R363.采用RACE方法获得该克隆的全长cDNA(GenBank登陆号:AY461414).序列分析表明,该基因长1156 bp,含有873 bp的阅读框,编码290个氨基酸,分子量约为32.9 kD,等电点为7.2,含有N-端跨膜螺旋区.同源性分析表明R363编码的蛋白质具有异戊烯基转移酶家族的特征,含有cis-异戊烯基链转移酶的5个高度保守区,推测R363可能是一种新的顺式-异戊烯基转移酶基因.Northern blot分析显示,R363在胶乳中高度表达,在叶中不表达.乙烯处理前后表达强度一致,表明该基因表达不为乙烯所诱导.     

巴西橡胶树一个AP2／EREBP转录因子的克隆及表达分析

本文采用RACE技术从巴西橡胶树中鉴定出一个AP2／EREBP转录因子。该转录因子全长cDNANl225bp,最长开放阅读框699bp,预测编码蛋白包含232个氨基酸;序列比对分析发现,该转录因子具有一段保守的AP2／EREBP结构域,与拟南芥Soloist（At4g13040）具有较高的相似性,将该基因命名HbSoloist。半定量胙PcR分析结果表明,HbSoloist在巴西橡胶树的胶乳、叶片、树皮和花中均有表达。与健康橡胶树相比,死皮树胶乳HbSoloist表达量明显下降。研究发HbSoloist表达受乙烯利、茉莉酸和低温处理调控,表明HbSoloist基因可能在巴西橡胶树乙烯、茉莉酸和低温反应中发挥作用。     

Allergenic proteins of natural rubber latex

As the living cytoplasm of laticiferous cells, Hevea brasiliensis latex is a rich blend of organic substances that include a mélange of proteins. A small number of these proteins have given rise to the problem of latex allergy. The salient characteristics of H. brasiliensis latex allergens that are recognized by the International Union of Immunological Societies (IUIS) are reviewed. These are the proteins associated with the rubber particles, the cytosolic C-serum proteins and the B-serum proteins that originate mainly from the lutoids. Procedures for the isolation and purification of latex allergens are discussed, from latex collection in the field to various preparative approaches adopted in the laboratory. As interest in recombinant latex allergens increases, there is a need to validate recombinant proteins to ascertain equivalence with their native counterparts when used in immunological studies, diagnostics, and immunotherapy.     

巴西橡胶树一个编码含有C2结构域蛋白cDNA的克隆及表达分析

本研究根据从巴西橡树胶乳cDNA文库中获得的一个EST片段的序列信息设计引物,通过RACE的方法获得了橡胶树编码含有C2结构域蛋白的cDNA(命名为HbC2)。序列分析表明,HbC2长为1185bp,含有813bp的阅读框,140bp的5'-UTR和232bp的3'-UTR,编码270个氨基酸,分子量为30.9KD,等电点为6.29,含有保守的C2结构域。半定量RT-PCR分析表明HbC2在花、芽、叶、胶乳和树皮中都有表达,其中在胶乳中表达量最高。茉莉酸可抑制HbC2的表达,乙烯对HbC2的表达没有影响。此研究为进一步研究C2蛋白基因在橡胶树中的生物学功能奠定基础。     

巴西橡胶树的分子生物学研究进展

巴西橡胶树是一种重要的热带经济作物,由于橡胶树体内橡胶含量多,且容易采收,所以橡胶树一直是天然橡胶的商业来源。相比于模式植物和粮食等经济作物来说,分子生物学研究显滞后。,而且橡胶树是多年生乔木,经济性状多集中于胶乳,因此研究难度大,研究也不多,本就巴西橡胶的分子生物学方面的研究进行综述。     

一种快速、高效的橡胶树胶乳总RNA 提取方法

胶乳是橡胶树(Hevea brasiliensis)乳管中特殊的细胞质, 主要由橡胶粒子、黄色体、F-W粒子和普通细胞质成分构成, 其中橡胶粒子占20%-40%, 蛋白含量高达1%-2%。由于高比例橡胶粒子和蛋白质的干扰, 目前使用的胶乳RNA提取方 法都具有步骤繁琐、胶乳需求量大、操作技巧性强不易掌握等缺点。为快速、高效地获取高质量的胶乳RNA, 我们在现有方法的基础上摸索出一套步骤简单、容易操作、快速、高效提取橡胶树胶乳总RNA的简易方法, 获得了较好的实验效果。紫外分光光度计、RT-PCR和RACE分析结果表明, 使用该方法提取的胶乳RNA质量完全能够满足相应的分子操作, 但所需时间仅为目前常用方法的50%, RNA获得率提高了2-3倍, 操作难度大大降低。