一步PCR快速扩增辽宁碱蓬甜菜碱醛脱氢酶cDNA 3'末端序列

根据已获得的辽宁碱蓬甜菜碱醛脱氢酶cDNA的部分序列,设计一条基因特异性引物,与通用引物并用,一步PCR成功地克隆了辽宁碱蓬甜菜碱醛脱氢酶cDNA 3′末端。与常规的3′RACE法相比,一步PCR法具有快速、简便、经济等优点,是一种非常快捷的扩增cDNA 3′末端序列的方法。 Abstract:Based on part of a known cDNA sequence of Suaeda liaotungensis betaine aldehyde dehydrogenase,we successfully cloned the 3′cDNA end of S.lianotungensis betaine aldehyde dehydrogenase using one step PCR with a gene specific primer and universal primer.Compared with the typical 3′ RACE,one step PCR is rapid,simple and inexpensive.It is very rapid to amplify an unknown cDNA 3′end using this method.     

一步PCR法快速扩增辽宁碱蓬胆碱单加氧酶cDNA 3′末端序列

根据已获得的辽宁碱蓬 (SuaedaliaotungensisKitag)胆碱单加氧酶cDNA的部分序列 ,设计一条基因特异性引物 ,与通用引物并用 ,一步PCR成功地克隆了辽宁碱蓬胆碱单加氧酶cDNA 3′末端。与常规的3′_RACE法相比 ,一步PCR法具有快速、简便、经济等优点 ,是一种非常快捷的扩增cDNA 3′末端序列的方法     

黑曲霉WY-6植酸酶的表达、纯化及性质研究

目的:表达黑曲霉WY-6植酸酶基因及研究重组酶的性质。方法:通过PCR方法从黑曲霉WY-6基因组中扩增出植酸酶基因,并将该基因表达在毕赤酵母中,再利用蛋白质分离纯化技术对重组酶进行纯化,并测定其性质。结果:黑曲霉WY-6植酸酶基因成功表达在毕赤酵母中,重组植酸酶经饱和硫酸铵分级沉淀、超滤和阴离子交换层析步骤后得以纯化,纯化后的植酸酶比活力为147U/mg,分子量为67kDa,两个最适pH分别为3.0和5.5,最适温度为55℃,与胃蛋白酶以0.01的比率(胃蛋白酶/植酸酶,wt/wt)混合作用2h后仍保留70.9%残余活力。结论:获得了具有商业应用潜能的基因工程植酸酶。     

辽宁碱蓬胆碱单加氧酶基因克隆及转基因烟草的耐盐性

甜菜碱是生物体内普遍存在的一种很有效的渗透调节剂.在高等植物中,甜菜碱由胆碱经两步酶催氧化得到,即:胆碱→甜菜碱醛→甜菜碱,催化第一步反应的酶是胆碱单加氧酶(choline monooxygenase,CMO).用RT-PCR和RACE技术从盐生植物辽宁碱蓬(Suaeda liaotungensis Kitag)中分离了CMO cDNA全序列,其中包括5′端非编码区123 bp, 3′端非编码区368 bp, 开放阅读框1 329 bp,编码一个由442个氨基酸构成的多肽,与菠菜、甜菜和山菠菜CMO的氨基酸序列同源性分别为77%、72% 和74%.克隆了其编码区,构建了植物表达载体pBI121-CMO,根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导转化烟草(Nictiana tabacum L.cv.89),获得卡那霉素抗性植株.PCR和Southern杂交均证明外源CMO基因已整合到烟草基因组中,转基因烟草的甜菜碱含量明显高于对照,转基因烟草膜的相对电导率明显低于对照,说明盐胁迫下转基因烟草的膜结构所受损伤小于对照,转基因烟草具有一定的耐盐性,能在含250 mmol/L NaCl的培养基中正常生长.     

大连蛇岛蝮蛇类凝血酶基因在毕赤酵母中的克隆表达及分离纯化(英)

根据同源性分析设计引物,通过RT-PCR方法从大连蛇岛蝮蛇毒腺总RNA中合成扩增出类凝血酶基因,之后将该基因克隆到表达载体pPIC9K中,经电激转化后整合至毕赤酵母细胞基因组中.经筛选得到甲醇快速生长型转化子His⁺Mut⁺在500 ml摇瓶中培养,甲醇诱导分泌表达.上清液中重组类凝血酶是通过两步柱层析得到：Q Sepharose FF和Benzamidine-Sepharose 4BCL.与天然蛇毒类凝血酶一致,分泌表达的重组类凝血酶具有较强的酯酶活性,但精氨酸甲酯如TAME的水解活性较弱.此重组类凝血酶在37℃中性溶液中保存过夜将分解成小肽,但在0℃下很稳定.该酶的最适pH为8.0.     

植物甜菜碱合成酶的分子生物学和基因工程

甜菜碱是一种非毒性的渗透调节剂。多种高等植物在盐碱或缺水的环境下在细胞中积累甜菜碱 ,以维持细胞的正常膨压。甜菜碱的积累使得许多代谢中的重要酶类在渗透胁迫下能保持活性。在植物中甜菜碱由胆碱经两步氧化得到 ,催化第一步反应的酶是胆碱单加氧酶 (CMO) ,催化第二步反应的酶是甜菜碱醛脱氢酶 (BADH)。本文综述了这两种酶的分子生物学及基因工程研究的最新进展 ,讨论了其基因工程研究的意义。     

一步PCR法快速扩增辽宁碱蓬胆碱单加氧酶cDNA 3′末端序列

根据已获得的辽宁碱蓬(Suaeda liaotungensis Kitag)胆碱单加氧酶cDNA的部分序列,设计一条基因特异性引物, 与通用引物并用,一步PCR成功地克隆了辽宁碱蓬胆碱单加氧酶cDNA 3′末端。与常规的3′_RACE法相比,一步PCR法具有快速、简便、经济等优点,是一种非常快捷的扩增cDNA 3′末端序列的方法。     

β—1，3葡聚糖酶与糖体失活蛋白融合基因的制备及表达载体的构建

将大豆的β－1,3葡聚糖酶基因与玉米的核糖体失活蛋白基因通过一个6个氨基酸的柔性短肽链连接起来,形成1个融合蛋白。编码区基因长1830bp,共编码609个氨基酸和1个终止密码子。经过使用蛋白质分析软件Antheprot4.3和Prosis(v5.00）对融合蛋白的二级结构、理化特性、潜在信号肽断裂位点等方面进行分析表明：融合蛋白较好的保持了原来的两个蛋白的各项理化特性,维持了两种蛋白的二级结构。将此基因克隆质粒PBI121上,构建成植物表达载体PBI／GR。     

菲降解菌Pseudomonas sp.JM2-gfp细胞特性对生物膜形成能力的影响及其在植物根表的定殖

[背景] 多环芳烃是农田土壤中的主要有机污染物,可通过作物根系进入食物链威胁人类健康。采用高效降解菌在植物根际形成生物膜是一种经济可行的生态阻控策略,而细菌细胞特性是影响其表面粘附并进行初始成膜的关键。[目的] 探究菲高效降解菌Pseudomonassp. JM2-gfp的细胞特性对自聚集成膜过程的影响,观察其在小麦根表定殖成膜情况,为在土壤-根际系统中构建阻控屏障提供理论依据。[方法] 采用培养皿培养、结晶紫染色、接触角测量（Contact Angle Measurement,CAM）及定量方法测定JM2-gfp菌株细胞特性,采用植物液体培养法形成生物膜,采用激光共聚焦显微镜（Confocal Laser Scanning Microscope,CLSM）、扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscope,SEM）观察和分析生物膜的结构特征。[结果] 菌株Pseudomonas sp. JM2-gfp生有鞭毛结构及疏水性细胞壁,并具备较强的运动能力、初始粘附率和自聚集能力。JM2-gfp菌株具有良好的成膜及降解能力,48 h菲降解效率是浮游态菌株的2.5倍。成膜过程呈现明显的周期性变化,2 d时生物膜量达最大值。2 d内生物膜厚度约为32.8μm,生物膜上分泌多种胞外基质物质（Extracellular Polymeric Substances,EPS）,其中碳水化合物和蛋白质含量分别为74.68 μg/mL和211.9 μg/mL。小麦根系与菌液共培养4 d后,JM2-gfp菌株可在根表形成稳定的生物膜,并进一步定殖到根和茎、叶组织内部。[结论] 菲胁迫下,Pseudomonas sp. JM2-gfp降解菌易于在载体表面附着聚集形成生物膜,降解能力也随之增强,其在植物根表定殖成膜的结果为阻控土壤有机污染物进入作物体内提供了一种新的技术策略。     

芘降解菌Pseudomonas sp.PR3的植物促生特性及其对芘胁迫下水稻生长的影响北大核心CSCD

农田中不断积累的多环芳烃不仅严重影响作物生长,同时增加粮食安全风险。筛选兼具促进植物生长特性和降解污染物功能的微生物菌株是解决上述问题的一种有效手段。从油田附近生长的植物根表分离得到一株具有芘降解能力,同时还具有溶磷、产吲哚乙酸和铁载体等植物促生特性的菌株PR3,经16S rDNA序列同源性分析确定为假单胞菌(Pseudomonas sp.)。菌株PR3在无机盐培养液中生长14 d后,对芘(20 mg/L)的降解率可达94%,对萘(50 mg/L)、菲(50 mg/L)、苯并(a)芘(10 mg/L)的降解率也分别达到92%,84%和47%。同时,该菌株7 d内最大溶磷量为756.25 mg/L,2 d内IAA合成量可达14.46 mg/L,4 d内生成铁载体的活性单位可达58.53%。在不同芘污染浓度处理下的盆栽实验表明,接种PR3可有效促进水稻生长并提高根际土壤中芘的降解,去除率可达72.02%-86.22%,同时显著降低水稻根及地上部中的芘含量,分别为21.81%-53.01%和49.81%-57.17%。因此,菌株PR3有助于实现芘污染土壤的生态修复以及降低作物芘暴露的风险。