阴离子交换色谱纯化甲型肝炎病毒(YN5株)的研究

对阴离子交换色谱纯化HAV的合适条件进行了探索。先使用“试管法”研究DEAE Sepharose Fast Flow凝胶结合HAV及病毒解离的条件,然后分别使用线性阶段洗脱和阶段梯度洗脱在柱色谱上进行了HAV的纯化。结果表明经过阴离子交换色谱纯化得到的病毒保持有抗原性和免疫原性,HAV抗原回收率大于85％,杂蛋白去除率大于80％,纯化的病毒样品中的内毒素与宿主DNA的含量也大大降低,证明阴离子交换色谱可用于HAV疫苗的纯化。     

HBsAg分子生物学与HBV疫苗研究进展

通过对ＨＢｓＡｇ的免疫原性、肝细胞嗜性及其与ＨＢＶ免疫病理的关系等研究,阐述了ｐｒｅＳ多肽对ＨＢＶ感染免疫应答的作用及其与肝细胞膜的相互作用。基于ｐｒｅＳ多肽在乙肝免疫中的重要性,使得乙肝疫苗的研究随着重组ＤＮＡ技术的发展从第一代血源乙肝疫苗到第二代基因工程疫苗特别是多肽或亚单位疫苗在产量、质量、免疫原性、安全性等方面的研究取得了长足的进展。     

甲型肝炎病毒Vero细胞适应株的选育研究

将甲肝患者粪便中分离的甲型肝炎病毒在Vero细胞中进行适应性培养 ,选育高滴度适应株应用于甲肝灭活疫苗研究。在Vero细胞上连续传代 ,测抗原滴度和感染性滴度 ,满意后按WHO推荐的甲型肝炎灭活疫苗规程进行灭活疫苗试制研究。经Vero细胞 14次适应性传代后 ,病毒抗原滴度可高达 1∶2 5 6 0 ,感染性滴度为 8.2 3LogC CID50 /ml。试制的灭活疫苗HPSEC检测在 2 80nm时仅有一个高峰 ,SDS PAGE电泳 ,在 2 2kD、2 6kD和 33kD处有三条蛋白带 ,和HAVVP3、VP2和VP1的位置相同。ICR小鼠效力试验表明疫苗剂量 16 0 0EU/ml与Merck疫苗5 0U效果相似。通过研究获得了Vero细胞甲肝病毒适应株YN5株 ,初步证明可作为甲型肝炎灭活疫苗的候选毒株。     

戊型肝炎病毒DNA免疫的研究

利用PCR方法获得1163bp的戊型肝炎（Hepatitis E Virus,HEV）开放读码框架（Open Reading Frame,ORF）ORF2之3'大片段和369bp ORF3的完整片段,分别克隆到真核表达载体pcDNA3中,构建两种含有HEV主要抗原表位的质粒DNA：pcE2和pcE3,分别或混合免疫Swiss小鼠三次（0时,第2周,第4周）,观察其在小鼠体内诱发的体液免疫应答。ELISA检测结果表明,pcE2和pcE3在小鼠体内均可诱导出一定水平的HEV IgG抗体,且在第三次免疫接种两周后,100％的小鼠抗体阳转。与两和中质粒单独免疫相比,两者同时注射的抗体水平较高。本研究为HEV DNA疫苗的研究打下一定基础。     

重组人血清白蛋白在汉逊酵母中的表达与纯化

优化人血清白蛋白（Human Serum Albumin, HSA）基因的密码子,合成基因连接到用于汉逊酵母（Hansenula polymorpha）表达的表达载体上,构建成重组人血清白蛋白（recombinant Human Serum Albumin, rHSA）表达质粒,转化汉逊酵母细胞,筛选得到的rHSA高表达细胞株HP-rHSA－C,30L发酵罐批式发酵表达量可达1.033g/L,经Streamline SP,Phenyl Bio-Sep 6FF,DEAE Sepharose层析分离获得纯化蛋白,除菌过滤后稀释,进行小鼠免疫原性分析,结果与人血清中提取的人白蛋白具有相同的抗原、抗体反应特性。     

人白细胞介素11的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

从人胚肺二倍体细胞ＫＭＢ１７抽提总ＲＮＡ,经ＲＴ－ＰＣＲ扩增到人ＩＬ－１１ｃＤＮＡ,克隆于ｐＢＳ－ＳＫ,以双脱氧链终止法进行序列分析;扩增去除Ｎ 端第一个氨基酸的ＩＬ－１１ｃＤＮＡ,克隆于硫氧还蛋白融合表达载体ｐＴｈｉｏＨｉｓＡ,经过对表达质粒的改造,使融合表达的ＩＬ－１１能被肠激酶精确切割;表达产物经金属鏊合亲合层析后经肠激酶切,再通过阳离子交换层析纯化后,用其依赖细胞株７ＴＤ１检测活性．结果表明,克隆的ＩＬ－１１ｃＤＮＡ 序列与文献报道一致;表达的融合蛋白占菌体总蛋白的３０％ 左右,以可溶性形式存在;纯化产物具有维持依赖细胞株生长的能力．由此,获得了较高纯度的具有生物学活性的ｒｈＩＬ－１１,为中试生产奠定了基础．     

戊型肝炎病毒DNA免疫的研究

利用PCR方法获得1 163 bp的戊型肝炎（Hepatitis E Virus,HEV）开放读码框架(Open Reading Frame,ORF)ORF2之3’大片段和369bp ORF3的完整片段,分别克隆到真核表达载体pcDNA3中,构建两种含有HEV主要抗原表位的质粒DNApcE2和pcE3,分别或混合免疫Swiss小鼠三次（0时,第2周,第4周）,观察其在小鼠体内诱发的体液免疫应答。ELISA检测结果表明,pcE2和pcE3在小鼠体内均可诱导出一定水平的HEVIgG抗体,且在第三次免疫接种两周后,100%的小鼠抗体阳转。与两种质粒单独免疫相比,两者同时注射的抗体水平较高。本研究为HEVDNA疫苗的研究打下一定基础。     

戊型肝炎病毒Ⅳ型ORF2蛋白在汉逊酵母中的表达

为了寻求新型表达系统来研制戊型肝炎基因工程疫苗,利用甲基营养型汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)系统表达戊型肝炎病毒(HepatitisEvirus,HEV)Ⅳ型结构区ORF2编码蛋白第112-607氨基酸片段。为实现目的基因在汉逊酵母中的高效表达,根据汉逊酵母偏爱密码子优化设计目的基因,用搭桥PCR法合成优化后的基因序列,并克隆到多拷贝表达载体上,转化汉逊酵母营养缺陷宿主菌ATCC26012(Ura3-),在选择培养基上培养,运用PCR法筛选得到携带外源基因的重组菌株,然后用含甲醇的培养基诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE、ELISA和Westernblot检测和鉴定。SDS-PAGE实验结果表明目的蛋白分子量约为56kD,表达量占菌体总蛋白的12%;ELISA检测结果表明表达产物为具有免疫反应性的HEVORF2蛋白,ELISA效价最高可达1∶2048,目的蛋白表达量随着基因拷贝数的增加呈升高的趋势;Westernblot鉴别实验结果证实表达产物与HEV多抗有特异性抗原抗体结合反应。HEV结构区ORF2蛋白在汉逊酵母中的成功表达,为研制基因工程戊型肝炎疫苗奠定了基础。     

两种pUC18高效T载体的构建

T载体是用于直接克隆PCR产物的线性载体.在此之前,克隆PCR片段时一般先用Klenow片段酶或T4DNA聚合酶削平PCR产物两端,克隆过程中又大都不能使用碱性磷酸酶为载体片段脱磷,因为绝大多数PCR引物5’端未磷酸化,T载体的诞生使分子生物学工作者摆脱了这一窘境,而且,T载体的3’端突出的T碱基与PCR产物3’端由于Taq酶非模板依赖的末端转移酶活性而添加的A碱基[1]互补,使载体与PCR产物的连接效率大大提高.由于具有上述优点,T载体从一产生就引起人们极大的兴趣,很多公司也相继推出了各自的T载体系统,并运用该技术改造了很多传统载体.本…