高分辨率高精度天花粉晶体结构研究 1．1分辨率衍射数据的收集

以同步辐射作为Ｘ射线源,在Ｓａｋｓｂｅ无屏ＷｅｉｓｓｅｎｂｕｒｇＸ－射线衍射数据收集系统上,应用磷光可逆成像屏（ＩｍａｇｅＰｌａｔｅ）作为记录装置,收集了天花粉蛋白正交晶体１．１Ａ分辨率的衍射数据。经ＷＥＩＳ程序处理和合并后,共获得独立衍射点６７．３２７个,占１．１Ａ分辨率范围应有反射总数的６９．８％;Ｒｍｅｒｇｅ＝５．９０％,表明数据的质量优良。这为特高分辨率天花粉蛋白的晶体结构研究奠定了坚实基础。     

neo Trichosanthin及其突变体Y70A neo Trichosanthin的晶体结构研究

天花粉蛋白（Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ,ＴＣＳ）的一个亚型,ｎｅｏＴｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ（ｎ－ＴＣＳ）,及其突变体Ｙ７０Ａｎ－ＴＣＳ被克隆和表达为重组蛋白。用悬滴汽相扩散法得到ｎ－ＴＣＳ和Ｙ７０Ａｎ－ＴＣＳ的晶体。在ＭａｒＲｅｓｅａｒｃｈ面探测器系统上分别收集了０．２０ｎｍ和０．２０５ｎｍ分辨率的Ｘ射线衍射数据。用同晶差值傅立叶法解析了结构。最后晶体学Ｒ因子分别为０．１８３和０．１８４。键长的     

高活力胰岛素研究：B3—Lys猪胰岛素的结晶及初步晶体学分析

用化学半合成方法制备的Ｂ３—Ｌｙｓ猪胰岛素（Ｂ３ＫＰＩ）具有与天然猪胰岛素相同的体内生物活力,但其体外生物活力及受体结合活力比天然猪胰岛素高。本文报道Ｂ３ＫＰＩ的晶体生长,初步晶体学分析及衍射数据与处理。Ｂ３ＫＰＩ晶体的衍射分辨率可以达到２．１Ａ（１Ａ＝０．１ｎｍ）,空间群为Ｒ３,晶胞参数为：ａＨ＝ｂＨ＝８２．２３ＡＣＨ＝３４．１７Ａ．收集了一套２．１Ａ分辨率的衍射数据,数据完全度为８１％,Ｒｍｅｒｇｅ为２．９％。     

天花粉蛋白Glu160在N-糖苷酶活性中的作用

用浸泡法得到了（Ｅ１６０Ａ）天花粉蛋白（ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ, ＴＣＳ）,（Ｅ１６０Ｄ）ＴＣＳ与Ａｄｅ 和（Ｅ１６０Ａ）ＴＣＳ与ＦＭＰ复合物的晶体．在Ｍａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ 面探测器系统上分别收集了０．２０ ｎｍ ,０．１９ｎｍ 和０．２０５ ｎｍ 分辨率的Ｘ 射线衍射数据,数据处理用Ｍａｒ Ｓｃａｌｅ 程序系统完成．用同晶差值Ｆｏｕｒｉｅｒ法解析了（Ｅ１６０Ａ）ＴＣＳ－Ａｄｅ,（Ｅ１６０Ｄ）ＴＣＳ－Ａｄｅ 和（Ｅ１６０Ａ）ＴＣＳ－ＦＭＰ的晶体结构,结构修正利用Ｘ－ＰＬＯＲ程序,修正结果,晶体学Ｒ因子分别为０．１６６,０．１７６,０．１７９．键长和键角的ＲＭＳ偏差分别为０．００１０ ｎｍ 和２．５０３°,０．００１３ ｎｍ 和２．６６５°,０．００１２ ｎｍ 和２．６７６°．在这三个结构中均未见到Ｇｌｕ１８９侧链方向的改变．Ａｄｅ 或ＦＭＰ仍结合在Ｎ－糖苷酶活性口袋之中,它夹在Ｔｙｒ７０和Ｔｙｒ１１１两个侧链环之间,与Ｔｙｒ７０环近乎平行．这一结果表明：ＴＣＳ中的Ｇｌｕ１６０分别突变成Ａｌａ 和Ａｓｐ,仍能与ＡＭＰ发生Ｎ－糖苷酶反应,但是活性降低了一些．可见Ｇｌｕ１６０对ＴＣＳ与ＡＭＰ的作用是重要的,但不是必要的．     

鸡传染性支气管炎病毒S1基因在昆虫细胞中表达水平初探

将含有鸡传染性支气管炎病毒 Ｓ１ 基因ｃ Ｄ Ｎ Ａ 的重组转移质粒ｐ Ｓ Ｘ Ｉ Ｖ Ｖ Ｉ＋ Ｘ３ Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ 和ｐ Ｓ Ｘ Ｉ Ｖ Ｖ Ｉ＋ Ｘ３／４ Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ 分别与粉纹夜蛾核型多角体病毒 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ Ｓ Ｖ Ｉ－ Ｇ Ｄ Ｎ Ａ（ Ｏ Ｃ Ｃ－ ,ｇａｌ＋ ） 共转染草地夜蛾（ Ｓｆ９） 细胞,经空斑纯化得到重组病毒 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ（ Ｘ３） Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ Ｏ Ｃ Ｃ＋ 和 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ（ Ｘ３／４） Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ Ｏ Ｃ Ｃ＋ 。将重组毒株分别感染 Ｔｎ５ Ｂ１ 细胞,并进行 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 与 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ 检测。结果表明, Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ（ Ｘ３／４） Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ Ｏ Ｃ Ｃ＋ 在感染的细胞中高效表达了 Ｓ１ 蛋白, Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 凝胶薄层色谱分析结果显示,感染病毒后７２ ｈ Ｓ１ 蛋白的表达量占细胞内总蛋白量的３５ ．８ ％ ,而 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ（ Ｘ３） Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ Ｏ Ｃ Ｃ＋ 感染的细胞内检测不出 Ｓ１ 蛋白。经分析认为这一差异主要来自 Ｓ１ 基因翻译起始位点及其附近的周围环境。     

天花粉凝集素的晶体学研究

天花粉凝集素是从中药天花粉瓜蒌块根中分离出的一种能专一结合糖类的新蛋白质。用悬滴汽相扩散法培养出了该蛋白质的晶体,最大线度尺寸达１．１ｍｍ。该晶体属正交晶系,空间群为Ｐ２１２１２１,晶胞参数ａ＝４４．７,ｂ＝６９．５,ｃ＝１８０．９,晶胞内每个不对称单位含１个天花粉凝集素分子。收集了３．０分辨率的衍射数据,并以具有某些相似性能的已知蛋白质结构为模型,做了分子置换研究。本文报导天花粉凝集素的晶体培养及Ｘ射线晶体学研究的初步结果。     

斑头雁脱氧血红蛋白的晶体生长及X射线晶体学的初步研究

报导了以Ｎａ２Ｓ２Ｏ４为还原剂制备脱氧血红蛋白,并以聚乙二醇溶液为沉淀剂,在ｐＨ７．２,蛋白浓度２０ｍｇ／ｍｌ条件下培养出适合于Ｘ射线分析用的斑头雁脱氧血红蛋白晶体,经Ｘ射线平面探测仪收集衍射强度数据和处理。确定晶体属三斜晶系,空间群Ｐ１,晶胞参数α＝７．０９ｎｍ,ｂ＝９．５４ｎｍ,ｃ＝５．８７ｎｍ,α＝７２．８°,β＝６５．９°,γ＝８２．０°,ｖ－３４６．１ｎｍ３,每个不对称单位包含２个四聚体分子,共收集２．８分辨率的独立衍射点３０６５４个,Ｒｍ因子为５．１４％。     

核糖体RNA拓扑学与RNAN－糖苷酶研究进展（下）

２８ＳｒＲＮＡ的α－ｓａｒｃｉｎ结构域直接参与核糖体催化的蛋白质合成反应,已经证明天花粉蛋白是一种ＲＮＡＮ－糖苷酶,一种测定ＲＮＡＮ－糖苷酶活力的新方法也已初步建立。天花粉蛋白能使超螺旋ＤＮＡ解旋并断裂为缺口环状和线状ＤＮＡ．并已发现其它ＲＮＡＮ－糖苷酶也具有这一核酸内切活性。天花粉蛋白对２８ＳｒＲＮＡ,超螺旋ＤＮＡ和艾滋病毒（ＨＩＶ－１）ＲＮＡ三种底物可能有相同的分子作用机制．     

氧化修饰高密度脂蛋白对培养人动脉平滑肌细胞细胞周期蛋白D_1基因表达的影响

动脉平滑肌细胞（ｓｍ ｏｏｔｈ ｍ ｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ,ＳＭＣ）是动脉粥样硬化（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ,ＡＳ）斑块中的主要细胞,它的增殖在ＡＳ形成过程中极其重要．利用体外培养的人主动脉ＳＭＣ,观察了天然高密度脂蛋白（ｎａｔｉｖｅ ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ,Ｎ－ＨＤＬ）及氧化修饰ＨＤＬ（ｏｘｉｄｉｚｅｄ ＨＤＬ,ＯＸ－ＨＤＬ）对培养人主动脉ＳＭＣ ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１（细胞周期蛋白Ｄ１）基因转录表达的影响．结果表明：（１）Ｎ－ＨＤＬ对ＳＭＣｃｙｃｌｉｎ Ｄ１基因表达无影响（Ｐ＞ ０．０５）;（２）ＯＸ－ＨＤＬ使ＳＭＣｃｙｃｌｉｎ Ｄ１基因表达显著增强（Ｐ＜０．０１）,其表达量随时间（２、１２、２４ ｈ）延长而增加．上述结果表明,ＯＸ－ＨＤＬ的致ＡＳ作用可能与其刺激ＳＭＣｃｙｃｌｉｎ Ｄ１基因表达增加有关．     

环氧化物水解酶1基因（EPHX1）多态性与新生儿出生体重间关系分析

为研究母亲环氧化物水解酶１基因（ＥＰＨＸ１）多态性与新生儿出生体重间关系。收集了某纺织厂３４２名女工的资料,用ＰＣＲ－限制性片段长度多态性法分析母亲ＥＰＨＸ１基因型,采用多元线性逐步回归模型分析母亲ＥＰＨＸ１多态性与新生儿出生体重关系。结果发现调整主要混杂因素后ＥＰＨＸ１的Ｈｉｓ１３９Ａｒｇ／Ａｒｇ１３９Ａｒｇ基因型与新生儿出生体重有显著性相关（β±ＳＥ＝－１４９ｇ ± ５６,Ｐ＝— ０．００８３）。经被动吸烟分层分析,结果显示：仅在有被动吸烟史人群中ＥＰＨＸ１的Ｈｉｓ１３９Ａｒｇ／Ａｒｇ１３９Ａｒｇ基因型与新生儿出生体重有显著性相关,（β±ＳＥ＝－ ２３４ｇ ± ８８,Ｐ＝ ０．００８８）;而根据工作紧张程度分层分析后发现,仅在有工作紧张史人群中发现ＥＰＨＸ１的Ｈｉｓ１３９Ａｒｇ／Ａｒｇ１３９Ａｒｇ基因型与新生儿出生体重有显著性相关（β±ＳＥ＝－ １５７ｇ ±ｔ ５９, Ｐ＝ ０．００７９）。我们的结果显示母亲 ＥＰＨＸ１多态性与新生儿出生体重有显著性相关,并存在基因－环境的交互作用。     

天花粉蛋白与FMP复合物的晶体结构

用浸泡法得到了天花粉蛋白（ＴＣＳ）与ＦＭＰ复合物的晶体,在ＳＩＭＥＮＮＳＸ－２００Ｂ面探测器系统上收集了一套２．０分辨率的Ｘ射线衍射数据。用同晶差值傅立叶法解析了复合物的结构,经Ｘ—ＰＬＯＲ程序修正得到了ＴＣＳ—ＦＭＰ复合物的分子结构并找出了１９７个水分子,最后的Ｒ因子为０．１７２,键长和键角的ＲＭＳ偏差分别为０．０１５和２．９２２度。ＴＣＳ—ＦＭＰ复合物中,ＦＭＰ与天花粉蛋白分子有较好的结合,其结合位置正处于根据三维结构和突变体信息推测的Ｎ一糖苷酶活性口袋之中。它的类嘌呤环夹在Ｙ７０和Ｙ１１１两个侧链环之间,与Ｙ７０环近乎平行,其Ｎ７和Ｎ６分别与ＴＣＳ分子的Ｇ１０９４羰基氧和Ｉ７１的Ｎ成氢键,Ｎ３靠近Ｒ１６３的侧链,其磷酸根则伸向活性口袋的底部,与Ｅ１８９、Ｅ１６０和Ｒ１６３等残基作用。     

^1HNMR法研究天花粉蛋白的伸展

~１ＨＮＭＲ法研究天花粉蛋白的伸展胡红雨,鲁子贤,杜雨苍（中国科学院上海生物化学研究所,２０００３１）关键词天花粉蛋白;Ｈｉｓ_（５１）残基;~１ＨＮＭＲ;肽链伸展天花粉蛋白（Ｔｒｉｏｈｏｓａｎｔｈｉｎ,ＴＯＳ）是分子量为２８０００,共有２４７个氨基酸?..     

人血管内皮细胞生长因子受体Flt—1胞外区cDNA在毕赤酵母中的？…

将编码血管内皮细胞生长因子受体ＦＩｔ－１胞外区１－３ｌｏｏｐ３１６个氨基酸残基的ｃＤＮＡ插入到含ＡＯＸ１启动子和α分泌信号肽序列的Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ酵母载体中,构建了重组表达质粒ｐＰＩＣ９Ｋ／ＦＩｔ＝１（１－３）,转化酵母景菌ＧＳ１１５,筛选Ｈｉｓ＾＋Ｍｕｔ＾ｓ表型转化子,经插瓶培养,１％甲醇诱导表达４ｄ后,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果显示,培养上清中ＦＩｔ－１（１－３）表达这总蛋白的３０－％     

GST融合蛋白在杆状病毒系统中表达的可溶性研究

将构建好的可表达ＧＳＴ融合蛋白的重组病毒ＡｃＭＮＰＶ－ＯＣＣ＾－－ＧＳＴ－６ｘＨｉｓ－Ｅｔｐ２８感染Ｓｆ９细胞,一定时间后取感染了病毒的细胞裂解物上清液进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,结果显示５３ｋＤａ的融合蛋白（ＧＳＴ－６ｘＨｉｓ－Ｅｔｐ２８）呈不溶状态。在原有裂解液的基础上,加固体十二烷基肌氨酸钠致终浓度１．５％,并将Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００的比例由１％提高到２％。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果显示至少有１／     

天花粉同工凝集素－1双链的拆分和鉴定

天花粉同工凝集素－１经巯基乙醇还原,碘代乙酰胺保护,其链间二硫键被打开,但仍非共价结合在一起。我们利用尿素变性的Ｑ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ离子交换层忻分离了此凝集素的两条链。氨基酸组成测定与其他３种肽链作一比较,它们都含有较多的酸性和羟基氨基酸。蛋白质印迹显示ＴＫＬ的抗血清不仅能与ＴＫＬ－１的两条链分别反应,也能与天花粉毒蛋白及蓖麻毒蛋白的Ａ链起作用。溴化氰裂解的ＳＤＳ－ＰＡＧＥＲ肽谱表明天花粉凝集素的两条链与天花粉毒蛋白含有类似的裂解片段,在分子量１６ｋｄ左右有相同的电泳条带。ＴＫＬ－１两亚基的Ｎ末端序列已经测定,同源性比较发现其３３ｋｄ亚基的Ｎ末端序列与天花粉毒蛋白、蓖麻毒蛋白的一些肽段类似。迄今已有的证据表明ＴＫＬ与ＴＣＳ等是一些非常相关的蛋白质。     

Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制剂cDNA在P.pastoris酵母菌中的表达和鉴定

将编码３７９个氨基酸残基的ＰＡＩ－１ｃＤＮＡ插入到含ＡＯＸ１启动子和ＰＨＯ１分泌信号肽序列的甲醇营养型酵母载体中,构建成表达质粒ｐＹＩＳ－１．表达质粒转化Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ甲醇营养型酵母细胞,筛选Ｈｉｓ＋Ｍｕｔ－表型的转化子,经低密度摇瓶培养,１％甲醇诱导表达７ｄ后,培液经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,ＰＡＩ－１生物活性测定和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证实表达出分子量为４３～５１ｋＤ的４条ＰＡＩ－１条带．表达的ＰＡＩ－１能有效地分泌到培液中,占培液总蛋白的２６％左右,达４ｍｇ／Ｌ培液;其比活性为１．１６×１０４ＡＵ／ｍｇ．不同分子量ＰＡＩ－１可能与其糖基化程度不同有关     

天花粉同工凝集素—1双链的拆分和鉴定

天花粉同工凝集素－１经巯基乙醇还原,碘代乙酰胺保护,其链间二硫键被打开,但仍非共价结合在一起。我们利用尿素变性的Ｑ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ离子交换层析分离了此凝集素的两条链。氨基酸组成测定与其他３种肽链作一比较,它们都含有较多的酸性和羟基氨基酸。蛋白质印迹显示ＴＫＬ的抗血清不仅能与ＴＫＬ－１的两条链分别分应,也能与天花粉毒蛋白及蓖麻毒蛋白的Ａ链起作用。溴化氰裂解的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ肽谱表明天花粉凝集素的     

亚天花粉蛋白突变体R163Kn-TCS及其复合物R163Kn-TCS/Ade的晶体结构

用悬滴汽相扩散法得到Ｒ１６３Ｋ ｎ－ＴＣＳ的晶体,并用ＡＭＰ浸泡４８小时后利到复合物晶体。在Ｍａｒ－Ｒｅｓｅａｒｃｈ面探测器系统上分别收集了０．２０５和０．１８７分辨率的Ｘ－射线衍射数据。采用同晶差值傅立叶法解析结构,用Ｘ－ＰＬＯＲ软件包进行修正,最后两模型的偏差因子（Ｒ和Ｒｆｒｅｅ）分别为（０．１８７和０．２６３）和（０．１８０和０．２３３）,键长偏差都为０．００１３ｎｍ,键角偏差分别为２．７９     

江浙蝮蛇毒溶血毒素晶体培养及初步晶体学研究

从江浙蝮蛇中分离纯化的碱性磷脂酶Ａ２在ｐＨ９．５,０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ ＣＨＥＳ缓冲液中,用汽相悬滴扩散的方法,获得了适用于高分辨率Ｘ射线结构分析的单晶。经Ｘ２００Ｂ面探测器分析,表明该晶体属于正交晶系,Ｐ２Ｉ２Ｉ２Ｉ空间群,晶胞参数为ａ＝９７．１３Ａ,ｂ＝１０３．６９Ａ,ｃ＝２３．２７Ａ。并收集了一套衍射数据,独立衍射点数１２００１个,数据完整度为８６．２％,Ｒｍｅｒｇｅ为０．０４５９。最高分辨     

亚天花粉蛋白突变体(R163H n-TCS和R163Q n-TCS)的晶体结构研究

用悬滴汽相扩散法得到了Ｒ１６３Ｈｎ－ＴＣＳ和Ｒ６１３Ｑｎ－ＴＣＳ的晶体,Ｍａｒ－Ｒｅｓｅａｒｃｈ面探测器系统上分别收集了０．２００和０．２０５ｎｍ分辨率的Ｘ－射线衍射数据,采用同晶差值傅立叶法解析结构,用Ｘ－ＰＬＯＲ软件包进行修正,最后的晶体学Ｒ因子分别为０．１８４和０．１８５,键长偏差分别为０．００１３ｎｍ和０．００１４ｎｍ,键角偏差分别为２．５９０和２．８１５,结构测定显示Ｒ１６３Ｈｎ－ＴＣＳ