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以重组PAI-(rPAI-1)为抗原,通过杂交瘤技术获得6株阳性杂交瘤细胞(Apl、AP2、AP3、AP4、AP5和AP6),并用SPA亲和层析纯化了抗Pal-1单克隆抗体(McAb)。所有McAb均能识别rPAI和天然PAI-1,腹水滴度均为10 6以上。6种McAb对PAI-1亲和常数在3.45×107--1.05×109mol/L之间。AP2、AP3McAb能完全抑制PAI-1活性,AP4、AP和AP6只能部分抑制PAI-1活性,Apl则不抑制PAI-1活性。6种McAb中只有Apl、AP4和AP5能识别Pal-1/t-PA复合物。利用Apl、AP3、和AP4 McAb制备免疫亲和柱一步纯化HepG2细胞分泌的PAI-1,纯度大于98%,回收率92%,纯化倍数51倍。利用抗PAI-1 McAb建立了夹心法ELISA,测定了人血浆PAI-1水平,正常人血浆PAI-1平均含量(X士D)为24.7±7.75ng/ml。 相似文献
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组织型转谷氨酰胺酶 (tissuetransglutaminase ,tTG ,TGII)是转谷氨酰胺酶家族成员之一 ,多数细胞凋亡过程中均有tTG表达水平的升高。为研究tTG在细胞凋亡过程中发挥作用的机制 ,利用Gal 4酵母双杂交系统筛选了HeLa细胞中与tTG相互作用的蛋白质 ,获得了 17个阳性酵母克隆。序列测定显示其中 1个克隆所含cDNA序列编码TIA 1相关蛋白 (TIA 1 relatedprotein ,TIAR )C端 12 9个氨基酸残基序列 ,GST下拉 (pull down)实验也证实tTG与TIAR能相互作用 ,而且这种相互作用需要Ca2 参与作用。这些结果提示tTG可能通过其Ca2 依赖的转谷氨酰胺活性对TIAR进行修饰从而影响TIAR的功能 ,可能在细胞凋亡中发挥着一定的作用。 相似文献
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为了观察尿激酶受体(uPAR)反义核酸对肿瘤细胞体外侵袭的抑制作用,用PCR方法扩增uPAR cDNA 5′端-46 bp~+454 bp一段长500 bp的序列,利用DNA重组技术将其克隆到病毒载体pAdeno-X中, 构建出重组腺病毒载体pAdeno-X-uPAR(-)和pAdeno-X-uPAR(+).线性化后的重组腺病毒载体转染HEK293细胞7天后,可以获得滴度分别为1.5×108 pfu/ml和0.5×108 pfu/ml的uPAR反义和正义核酸表达重组腺病毒,分别命名为Ad-uPAR(-)和Ad-uPAR(+).以不同的病毒感染指数(MOI)感染人肺巨细胞癌高转移株95D肿瘤细胞,3天后用RNA印迹法可以检测肿瘤细胞uPAR正义和反义核酸表达水平,随着MOI的升高,Ad-uPAR(-)感染的肿瘤细胞uPAR蛋白水平逐渐下降,肿瘤细胞的体外侵袭能力也明显下降,而感染Ad-uPAR(+)的肿瘤细胞无明显变化.结果表明,重组腺病毒可以表达uPAR正义和反义核酸,uPAR反义核酸可以明显抑制人肺巨细胞癌高转移株95D肿瘤细胞在体外的侵袭能力. 相似文献
4.
采用Rotofor等电聚焦和分子筛技术纯化大肠杆菌表达的重组链激酶(r—SK),其纯度为97%。比活性1×106IU/mg,回收率41%。分析所纯化的r—SK N端氨基酸顺序证实其1—15个氨基酸顺序与SK基因的核苷酸顺序所示3联密码子一致。以纯化r—SK为抗原,通过杂交瘤技术构建了分泌抗r—SK单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞(4D11),该McAb属IgG1亚型.特异地作用于r-SK和C组口溶血性链球菌分泌的SK。用底物显色法测定该McAb可抑制SK对纤溶酶原的激活。Western blot法证实该McAb能识别分子量为16 250Da的r—SK的CNBr裂解片段。推测SK蛋白中第71残基至第237残基间的氨基酸顺序参与SK与纤溶酶原的结合。 相似文献
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干扰素调节因子3(IRF-3)是一种转录因子,它能对干扰素(IFN)的基因表达进行调控。它的激活是通过一系列位点的磷酸化来完成。近年来,人们对IRF-3的磷酸化调节进行了大量的研究,本文就以上研究进展作一综述。 相似文献
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尿激酶受体反义RNA抑制人乳腺癌细胞的侵袭作用 总被引:7,自引:2,他引:5
将尿激酶受体 u PAR反义 RNA表达质粒 p URAS以脂质体法转染高侵袭性人乳腺癌细胞株 MDA- MB- 2 31 ,G41 8筛选抗性克隆 .Northern印迹法检测 u PAR反义 RNA的表达 ,RT- PCR法检测 u PAR的表达 ,牛奶板法测定细胞培养上清中纤溶活性 .改良 Boyden小室模型和裸小鼠乳房脂肪垫接种试验分别检测肿瘤细胞体外和体内侵袭能力 .反义克隆细胞能表达 u PAR反义RNA,其 u PAR表达水平及培养上清中纤溶活性明显降低 .反义细胞克隆体外侵袭能力比原代细胞 MDA- MB- 2 31和转染载体细胞克隆显著降低 .裸小鼠体内侵袭实验表明 ,反义细胞克隆的成瘤性、生长性和侵袭性均显著受到抑制 .u PAR至少在一部分恶性乳腺癌侵袭行为中发挥重要作用 ,反义 RNA可望成为抗肿瘤侵袭治疗的一种有效手段 . 相似文献
7.
用 Northern印迹证实在 He La细胞中有 t TG的表达 ,且这种表达受 TNF-α的上调 .构建t TG反义真核表达质粒并转染 He La细胞 ,用 G41 8抗性筛选稳定表达的转染细胞 ,并用 Northern印迹和 t TG活性测定进一步分析反义 t TG的转录 .用结晶紫及 MTT法证实阳性细胞克隆获得了对 TNF- α的抗性 ,而转染表达载体 pc DNA3的细胞仍对 TNF- α敏感 .结果表明降低 t TG活性能使细胞对 TNF- α诱发的细胞凋亡敏感性降低 相似文献
8.
核转运蛋白Imp家族是在其核细胞中广泛存在的一类重要的蛋白质,其成员数目众多,在酿酒酵母菌中有一种Impα,而在脊推动物中现已发现8种不同的Impα。在酵母中有14种Impβ,而在哺乳动物细胞中有超过20种不同的Impβ。并且有新成员正在不断地被发现。Impα是由10个ARM重复序列形成的一个α起螺旋结构。Impβ与不同底物结合时,呈现出不同的构象,它也是由2或3个螺旋所组成的延伸的起螺旋结构。Imp家族成员通过Impβ的单独作用或Impα与Impβ1的协作结合其作用底物,在RM的调节下,完成对大分子蛋白质的穿越核膜的转运,并且以这一作用为基础,参与了细胞的信号转导,细胞分裂及生长发育,细胞调亡等重要生命活动。在细胞分裂时,Imp家族还可与Ran一起参与纺锤体的形成。 相似文献
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受体介导基因治疗存在的主要问题和可能的解决办法 总被引:4,自引:0,他引:4
载体是基因治疗的关键因素之一。从总体上来看 ,基因治疗的载体可以分为病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体介导的基因治疗取得了显著发展 ,是目前基因治疗的主要载体。但是病毒载体具有携带外源基因片段大小受到限制 ( 7kb左右 )、易引起机体收稿日期 :2 0 0 1 0 3 0 5作者简介 :孙兴会 (1975 - ) ,男 ,硕士生 ;朱运松 (1940- ) ,男 ,教授。免疫反应以及制备、贮存、质量控制比较困难等固有缺点 ,这促进了人们对非病毒载体介导基因治疗的研究。在过去的十多年里 ,人们对受体介导的基因治疗进行了广泛的研究 ,并取得了较大的进展。受体… 相似文献