淀粉酶链霉菌BAC基因组文库的构建及鉴定

提取淀粉酶链霉菌SM33基因组DNA,用Hind III部分酶解后回收40 kb～60 kb大小的高分子量DNA,与质粒载体pIndigoBAC536连接,电击转化EPI300感受态细胞,经蓝白斑筛选共挑取了5 184个白色克隆.从文库中随机挑选10个克隆,酶切检测平均插入片段约为50 kb,覆盖了32.4倍基因组.并且插入片段均具有9～15个Not I酶切位点,符合链霉菌基因组特征.通过对BAC文库的筛选,获得苹果酸脱氢酶基因(mdh)的保守序列,与已知的链霉菌mdh具有很高的相似性.淀粉酶链霉菌BAC基因组文库的建立,对基因克隆、基因组物理图谱、次级代谢途径、新抗生素的发现以及工业用酶的应用等研究均有重要意义.     

水稻线粒体atpA基因的克隆及其与细胞质雄性不育的关系

本研究以水稻BT型细胞质雄性不育系秋光和相应的保持系秋光为材料,提取线粒体DNA,用限制性内切酶完全酶解,以玉米线粒体atpA基因和波菜叶绿体atpA基因作为探针,进行分子杂交,将保持系线粒体atpA基因定位在3.5kb的Bam HI酶切片段上,并且以pBR322为载体,克隆了这一片段,另外,在Bam HI完全酶解普带的杂交结果中,不育系线粒体基因组中有两条阳性杂交带,分别是3.5kb和2.9kb,而保持系线粒体基因组中只有3.5kb一条阳性杂交带,因而认为水稻不育系线粒体基因组中可能有两个atpA基因拷贝,而相应的保持系线粒体基因组中只有一个atpA基因拷贝。     

水稻线粒体atpA基因的克隆及其与细胞质雄性不育的关系

本研究以水稻BT型细胞质雄性不育系秋光和相应的保持系秋光为材料，提取线粒体DNA，用限制性内切酶完全酶解，以玉米线粒体atpA基因和波菜叶绿体atpA基因作为探针，进行分子杂交，将保持系线粒体atpA基因定位在3.5kb的Bam HI酶切片段上，并且以pBR322为载体，克隆了这一片段，另外，在Bam HI完全酶解普带的杂交结果中，不育系线粒体基因组中有两条阳性杂交带，分别是3.5kb和2.9kb，而保持系线粒体基因组中只有3.5kb一条阳性杂交带，因而认为水稻不育系线粒体基因组中可能有两个atpA基因拷贝，而相应的保持系线粒体基因组中只有一个atpA基因拷贝。     

雨生红球藻基因组文库的构建及鉴定

本研究以雨生红球藻34-1n为材料,提取其基因组DNA,利用限制性内切酶Sau3AⅠ对基因组DNA进行酶解,回收6~8kb的基因组DNA片段,并浓缩至200ng/μL。该片段与经BamH Ⅰ酶切和去磷酸化处理后的pUC18载体连接,然后电击转化到受体菌Escherichia.coli DH5α中,获得雨生红球藻34-1n的基因组文库。该文库的平均插入片段长度约为6.5kb,获得6×105个克隆数。通过PCR筛选,由雨生红球藻基因组文库中获得含bkt1序列的单克隆菌,与β-胡萝卜素氧化酶序列(GenBank:DQ086233.1)进行比对,结果表明bkt1基因组序列含有6个外显子。本研究为进一步鉴定雨生红球藻相关基因提供了一个文库平台。     

莱茵衣藻基因组文库的构建

以莱菌衣藻CC-849为材料,提取基因组DNA,利用BamHⅠ和BglⅡ对基因组DNA进行酶解,获得了可用于构建基因组文库的6-12 kb的基因组片段,并浓缩至200 ng/μL。该片段与λDNA载体连接,经噬菌体蛋白包装、侵染大肠杆菌XL1-blue后,获得了莱菌衣藻基因组文库。该文库的滴度为2.12×10~5 pfu/mL,共有转化子4.26×10~4个,插入片段的平均长度约为9kb,扩增后基因组文库滴度为9.5×10~6 pfu/mL。     

大尺蠖核多角体病毒DNA的限制性消化和物理图谱

用5种限制性核酸内切酶消化大尺蠖核多角体病毒(BsNPV)基因组DNA,所得片段数分别是:BamH Ⅰ,9;Bgl Ⅱ,7;Xho Ⅰ,10;HindⅢ 13;EcoR Ⅰ,12,从各个片段的累加测出BsNPV基因组的平均大小约为91,75kb;分子量约为59.60×10~6d。在单酶消化的基础上,用BamH Ⅰ/Bgl Ⅱ双酶消化得到16个片段(即9+7);大小为91,27kb,用、Bgl Ⅱ/Xho Ⅰ双酶消化产生7+10=17个片段,大小为90.04kb,由此组建了这三个酶在BsNPV基因组上的物理图谱。     

氧化葡萄糖酸杆菌SCB329基因组的大小与结构的研究

收集维生素C产生菌氧化葡萄糖酸杆菌GluconobacteroxydansSCB32 9的纯培养对数期的菌体 ,采用凝胶包埋法制备完整染色体 ,用稀有酶切位点的限制性内切酶和脉冲场电泳技术对SCB32 9的基因组进行了分析 ,SpeⅠ (5′ ACTAGT)酶切有 2 4个片段 ,其大小从 1 0kb到32 0kb,用XbaⅠ (5′ TCTAGA)酶切产生 40个片段 ,其大小从 4kb到 2 0 0kb,综合两种限制酶酶切片段长度的总和结果 ,SCB32 9基因组大小为 2 70 0kb,SCB32 9基因组由一条 2 50 0kb的染色体和一个 2 4 5kb的质粒组成。通过用脱氧核糖核酸酶Ⅰ和S1核酸酶处理其基因组后电泳证实SCB32 9的染色体和质粒的拓扑学结构均为环状     

水稻线粒体DNA酶切带型研究

水稻IR36线粒体DNA经6种限制酶酶切,用脉冲电泳和长距离琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段,获得高分辨率的清晰带型。每组酶切片段加和测得水稻IR36线粒体基因组大小分别为227kb(HindⅢ)、253kb(EcoRⅠ)、253kb(XhoⅠ)、294kb(BamHⅠ)、239kb(SalⅠ)和283kb(xbal)采用9个来自水稻和玉米线粒体基因组的基因探针与酶切条带杂交发现,水稻线粒体基因组含有包括编码基因在内的重复顺序。     

放线菌噬菌体φHAU_3中噬菌斑形成必需功能区的克隆和定位

放线菌噬菌体φHAU3是以吸水链霉菌应城变种10-22为指示菌,筛选获得的一个广谱性噬菌体,其基因组大小约为53kb,具有粘性末端。已成功地将44.7kb的φHAU3 DNA克隆到pIJ255上,构建成噬粒(Phasmid)pIJ8300;46.8kb的φHAU3 DNA克隆到pIJ285上,构建成pIJ8301。采用部分酶解和Southern杂交的方法,制作了pIJ8300和pIJ8301被Asp718和Bgl Ⅱ酶切的限制酶图谱,又综合单,双和多酶切分析的结果,定位了单一的Pvu Ⅱ和NcoI切点。综合噬粒pIJ8300和pIJ8301的特性,已将φHAU3中噬菌体功能的必需区定位在41kb的范围内。这些结果为以φHAU3为母体发展新的放线菌噬菌体奠定了良好的基础。     

油桐尺蠖核型多角体病毒（羊楼洞株）基因组特性

用多种限制性内切酶单酶切、双酶切分析了油桐尺蠖核型多角体病毒（羊楼洞株）基因组DNA,同时用[α－32p）－dATP对几种酶的酶切产物进行末端标记。结果表明,此株病毒基因组约129kb,组成比较单一。与国内其它分离株基因组大小及酶切电泳图谱均有较大差别。     

对TMV不同抗性番茄品种的叶绿体DNA限制性内切酶酶谱分析

选用对TMV有抗性和敏感的番茄品种、制备其ct-DNA, 用限制性内切酶BumHI、EcoRI和PstI完全酶解, 三种酶切图谱与前人报道一致, 由酶切片段计算番茄ct-DNA。分子量约为156.9kb。比较抗性和敏感品种的ct-DNA图谱, 发现三种酶切图谱均存在差异, 但由差异片段计算分子量之和又很除近。我们推测这是由于检基顺序变异或小段DNA顺序插入或缺失所造成, 由此证明, 叶绿体基因组与核中的TMV抗性基因, 共同决定着植物体对TMV的抗性。     

泰泽病原体基因组DNA提取方法的建立

目的　提取泰泽病原体基因组DNA ,为建立该菌基因组文库奠定基础。方法　使用密度梯度离心结合酶解消化方法、酶解消化方法、本研究建立方法即过滤盐析离心法 ,从感染肝脏组织纯化泰泽病原体 ,并比较三种方法纯化泰泽病原体效果 ;采用氯化苄法、试剂盒、酚法提取泰泽病原体基因组DNA ,并比较三种方法提取基因组DNA质量 ;鉴定酚法提取泰泽病原体基因组DNA特异性。结果　使用过滤盐析离心法从感染肝脏组织纯化泰泽病原体 ,采用酚法提取其基因组DNA ,所获得的基因组DNA特异性好、纯度高、DNA片段长度大于 5 0kb ,且均一性好 ,无降解。结论　本研究首次成功提取泰泽病原体基因组DNA ,可用于多种分子生物学实验     

用PCR扩增和克隆鸡传染性贫血病毒全基因组DNA

根据已发表的序列,分别在鸡贫血病毒(CAV)环形基因组DNA(全长2.3kb)的EcoRI位点和BamHI位点的两侧选择适当序列合成两对引物,用PCR技术,从斑点杂交检测到病毒核酸的CAV感染的MDCC-RP1细胞基因组DNA中,分别扩增出包含EcoRI和BamHI分割开的病毒基因组两部分(1.5kb和0.8kb)约1.5kb和约1.25kb的两个片段.再将其中相应序列拼接克隆进pUC18载体,获得包含CAV全基因组序列DNA片段的克隆质粒pCAV2.4.酶切分析表明,该质粒具有预期的BamHI位点、PstI位点、HindⅢ位点,而预期的EcoRI位点消失.重组质粒插入DNA片段的两端序列分析表明,质粒pCAV2.4是包含CAV全基因组序列的重组质粒,插入DNA片段序列中的EcoRI位点序列发生了一个碱基突变.     

链霉菌M1033 D－木糖异构酶的分子克隆

链霉菌M1033染色体DNA经BamH Ⅰ酶解后电泳,Southern转移。根据自测的链霉菌M1033 D－木糖异构酶氨基酸序列设计合成寡聚核苷酸探针x－2、x－3,以x－2、x－3及Am－pullariella sp3876 D-木糖异构酶基因(1．17kb)为探针进行杂交,确定与上述探针杂交最强处在15kb左右。从胶上分离出g-20kb大小的片段,克隆到EMBL 3载体中,经杂交筛选后,得到0．6％的阳性噬斑,其插人大小为13kh。将插入DNA的saIⅠ酶解片段(2．5kb)进一步亚克隆于pucl8,得到重组质粒puB l,经酶解图谱、部分序列分析和互补实验确定puBl含有完整的M1033 D-木糖异构酶基因     

鸻形目鸟类线粒体基因组测序策略

鸻形目（Charadriiformes）,全世界约有384个物种,分属于19科94属,种类繁多、分布广泛,是研究迁徙和觅食行为的良好材料。近年来,线粒体基因组的研究快速发展,由于样品难以收集,缺乏系统的测序策略,鸻形目鸟类线粒体基因组的研究相对滞后。引物设计对聚合酶链式反应（PCR）至关重要,一个成功的PCR实验依赖于高质量的特异性引物,本研究拟设计一套用于鸻形目鸟类线粒体基因组扩增的通用引物。对GenBank中现有的鸻形目物种线粒体基因组进行多重比对,发现若干个保守性区域,本研究在该区域设计13对扩增鸻形目鸟类线粒体基因组的通用引物,扩增的目的片段长度均在1.5 kb左右。我们选取4个物种,即灰头麦鸡（Vanellus cinereus）、丘鹬（Scolopax rusticola）、白腰草鹬（Tringa ochropus）和针尾沙锥（Gallinago stenura）,进行PCR扩增验证,设计的引物在4个物种中均能顺利扩增、测序,该引物在鸻形目鸟类线粒体基因组扩增中的具有普遍适用性。本研究设计的13对通用引物在扩增鸻形目物种线粒体全基因组中具有较强的应用价值,将为鸻形目的系统发育关系、种群遗传学和生物地理学研究提供珍贵的资源。     

烟草种质资源AFLP分析中DNA模板的制备

采用CTAB法和SDS法提取烟草基因组DNA,经检测表明,CTAB法提取的基因组DNA纯度高于SDS法;CTAB法提取的DNA,其OD₂₆₀/OD₂₈₀值均高于1.8,相对分子量23kb左右,且能完全被EcoRⅠ和MseⅠ酶切消化,并能获得清晰的AFLP指纹图谱。     

油菜叶绿体基因组雄性不育特异DNA片段的定位

实验选用油菜湘矮不育系及同核保持系叶绿体DNA为材料,用4种限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、PstⅠ和SmaⅠ完全酶解。在EcoRⅠ酶解的保持系ctDNA图式中,观察到唯一的差异片段E3.2kb。将此片段连接于载体pUC9进行克隆,经克隆杂交及电泳分析鉴定,获得重组子。以rRNA基因为探针,与EcoRⅠ酶解的保持系ctDNA杂交,其中一条阳性带显示在差异片段E3.2。进一步以E3.2片段为探针,与经过限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ、salⅠ、BgⅢ、HindⅢ和PstⅠ酶解后的rRNA基因反杂交。根据rRNA基因图谱,这一与不育性有关的E3.2kb片段被定位于距16S rRNA基因5'端+2.0至+5.4kb的前导序列中。此结果表明,这段可能与花粉育性形成有关的片段定位于叶绿体基因组反向重复区。     

O139霍乱弧菌质粒基因组文库的建立及O抗原基因的筛选

合成O-抗原的基因是串联在一起的一个基因簇,提取O139霍乱弧菌基因组DNA,限制性内切酶EcoRⅠ酶切,电泳回收4～20kb的DNA片段,构建质粒基因组文库.随机筛选重组克隆,获得一株可与O139霍乱弧菌抗血清发生凝集反应的重组克隆,命名为大肠杆菌DH5a(pMG320).经鉴定分析重组克隆所表达的O-抗原具有良好的免疫原性及反应原性.酶切分析质粒pMG320,推知其O-抗原基因大小约4.6kb.这为今后O139霍乱疫苗的研制及O139霍乱弧菌O-抗原基因的结构和功能研究提供了条件.     

Gibson组装技术简化腺病毒载体反向遗传改造

重组腺病毒是常用的基因转移载体,本文介绍一种对腺病毒基因组进行反向遗传改造的策略。拟在维持基因编码蛋白氨基酸序列不变的前提下,突变去除重组人5型腺病毒Ad5GFP基因组的PmeI酶切位点。软件分析腺病毒质粒pAd5GFP序列,选择限制性内切酶BamHI将pAd5GFP切割为大小11.7和24.6kb两个片段,24.6kb大片段自身环化形成一个质粒pAd5GB,PmeI位于其上。PmeI/AscI双酶切pAd5GB质粒,产生2.4kb和22.2kb两个片段;在引物部位引入突变的PmeI位点(由gtttaaac突变为gtttaaaT),PCR扩增得到两端各延长30bp的上述2.4kb片段,与22.2kb片段进行Gibson组装,转化E.coli TOP10感受态细胞,得到pAd5GBXP质粒。BamHI酶切pAd5GBXP,碱性磷酸酶处理,与11.7kb片段连接,还原得到腺病毒质粒pAd5GXP。PacI线性化pAd5GXP质粒,转染293细胞,拯救得到Ad5GXP病毒;酶切分析证明Ad5GXP基因组不含有PmeI位点。研究结果说明将酶切连接与DNA组装技术相结合,能够方便灵活地对腺病毒基因组进行突变改造。     

利用长引物嵌套式反向PCR方法克隆雅致枝霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因上游序列

用限制酶EcoRⅠ、KpnⅠ分别对雅致枝霉As3.2806基因组DNA进行消化,而后在低浓度条件下利用T4DNA连接酶使DNA自身环化。根据已知基因序列,设计一对长度为35nt的长反向引物和两对较短的引物,以基因组连接产物为模板,通过三轮嵌套式PCR反应,获得一长度约为4kb的扩增片段。经序列测定表明得到了Δ6-脂肪酸脱氢酶基因上游序列约为1.3kb,初步序列分析显示该序列为一潜在的启动子序列。