大肠杆菌D一木糖异构酶基因的分子克隆与表达

经DNA体外重组,并以D-木糖异构酶缺陷型菌株互补加以检定,获得了大肠杆菌D-木糖操纵子克隆．通过次级克隆,分离得到了D-木糖异构酶基因克隆。为试图提高酶活力,将含有D-木糖操纵子和异构酶基因的克隆DNA片段,分别克隆若干个高拷贝质粒上,并且观察了不同宿主对基因表达的影响。实验结果表明,D-木糖操纵子和D-木糖异构酶基因在不同大肠杆菌菌株细胞中均能表达。     

琥珀酸弧菌L-天门冬酰胺酶基因的初级克隆和表达

本文以表达型噬菌体λgtll为载体,以及¹²⁵I标记的放射免疫抗体为探针,从EcDR I酶切的琥珀酸弧菌(Vyibrto succinogenes)染色体DNA片段中克隆得到携带天门冬酰胺酶基因的目的片段,在宿主菌E．Coil Y 1090 中得到表达。经酶解和凝胶电泳分析表明该插入DNA片段的分子量为5．8kb．重组DNA感染另一宿主菌E．ColiYl089后所产生的酶蛋白具有L-天门冬酰胺酶活力。用重组DNA(λgt11-AS8)为探针进行southern DNA杂交,琥珀酸弧菌染色体DNA的Ec0R I酶切片段中,出现一条位置在5．8kb处的杂交带,证明我们克隆到的携带L-天门冬酰胺酶基因的目的片段来自琥珀酸弧菌。     

苏云金芽胞杆菌cryⅡ基因的克隆和表达

分离的苏云金芽胞杆菌(Bacillus-thuringiensis)YBT-791对鳞翅目小菜蛾(Plutellaxylostella)有毒力,将其质粒DNA提纯,经HindⅢ酶切后与杀虫晶体蛋白cryⅡ基因探针杂交,显示出分子量分别为5kb和9．4kb两条DNA阳性片段。把5kb的DNA阳性片段克隆到pUCl8的HindⅢ位点上并转化大肠杆菌TGl,经酶切和杂交检测,证明斑点杂交阳性克隆子中含有5kb的cryI片段。把这个含cryⅡ基因的5kbHindⅢ片段进行亚克隆,将4kb的BamHI－Pstl酶切片段插入穿梭载体pXl61中,并用电脉冲法克隆于苏云金杆菌不产伴胞晶体的突变株中,得到产生单一cry Ⅱ基因编码的杀虫晶体蛋白的克隆菌株M一5。经电镜观察,该克隆菌株能形成出发菌YBT－791多种形态伴胞晶体中的一种方形伴胞晶体;经免疫双扩试验,它只能与Cry Ⅱ晶体蛋白抗血清形成沉淀线;经SDS—PAGE电泳,克隆菌的伴胞晶体只含有一种65kDa的晶体蛋白。生物测定结果表明它既对鳞翅目小菜蛾(Piutella xylostella)有毒性,又对双翅目致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)有毒性。     

油菜叶绿体基因组雄性不育特异DNA片段的定位

实验选用油菜湘矮不育系及同核保持系叶绿体DNA为材料,用4种限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、PstⅠ和SmaⅠ完全酶解。在EcoRⅠ酶解的保持系ctDNA图式中,观察到唯一的差异片段E3.2kb。将此片段连接于载体pUC9进行克隆,经克隆杂交及电泳分析鉴定,获得重组子。以rRNA基因为探针,与EcoRⅠ酶解的保持系ctDNA杂交,其中一条阳性带显示在差异片段E3.2。进一步以E3.2片段为探针,与经过限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ、salⅠ、BgⅢ、HindⅢ和PstⅠ酶解后的rRNA基因反杂交。根据rRNA基因图谱,这一与不育性有关的E3.2kb片段被定位于距16S rRNA基因5'端+2.0至+5.4kb的前导序列中。此结果表明,这段可能与花粉育性形成有关的片段定位于叶绿体基因组反向重复区。     

麦迪霉素产生菌酮基还原酶基因的研究

将麦迪霉素产生菌基因文库中与放线紫红索酮基还原酶基因actⅢ有同源性的4·0kb DNA片段克隆到质粒载体pWHM3中,构成重组质粒pCB4。将质粒pCB4转入酮基还原酶基因缺陷菌株——加利利链霉菌ATCC3167l中,得到转化子。转化子发酵产物经TLC和HPLC分析证明是阿克拉菌酮,与加利利链霉菌原株ATCC31133的产物相同,说明麦迪霉素产生菌酮基还原酶基因互补了加利利链霉菌ATCC31671中缺陷的酮基还原酶基因,使其恢复了产生阿克拉菌酮的能力。4．Okb DNA片段插入方向相反的重组质粒pCBR4在加利利链霉菌ATCC31671中发酵产物经TLC分析证明也是阿克拉菌酮,这说明4．0kbDNA片段中麦迪霉素产生菌酮基还原酶基因具有自身的启动子。对4．0kb DNA片段进行了限制酶酶切分析,建立了其酶切图谱。以actⅢ基因为探针,经分子杂交以及亚克隆和DNA转化实验,将麦迪霉索产生菌酮基还原酶基因定位于BssH Ⅱ—BamH Ⅰ 1．3kb DNA片段上。对1．3kb DNA片段核苷酸序列分析结果表明：此1．3kbDNA片段中含有一个独立的ORF,起始密码ATG,终止密码TAG,含783bp;在起始密码上游有GGAGG5个核苷酸SD序列;此ORF编码260个氨基酸,与actⅢ基因编码的261个氨基酸相似性为77．4%,相同性为66．7％,对麦迪霉素产生苗酮基还原酶基因的可能作用进行了讨论。     

7号淀粉酶链霉菌M1033木糖异构酶基因序列分析

测定了来自海南的7号淀粉酶M1033木糖异构酶(Ⅺ)基困的DNA序列。：该酶的结构基因由l161bp组成,相当于387个氨基酸残基。其GC含量为72．1克分子％,密码子第三位的Gc利用率达98克分子％。在氨基酸序列上,M1033的木糖异构酶与其它放线菌菌株的相比具有较高的同源性;特别是与3种链霉菌菌株的同源性高达90%左右。     

地中海拟无枝菌酸菌U-32硝酸还原酶的基因克隆

outhern杂交分析表明在地中海拟无枝菌酸菌u－32染色体DNA和黑曲霉niaD(硝酸还原酶基因)之间存在着明显的同源性。利用异源niaD探针从地中海拟无枝菌酸菌u－32基因文库中筛选得到一个能与niaD杂交的5.0kb的Pst Ⅰ片段。该片段经同位素标记后能与地中海拟无枝菌酸菌u－32染色体上一个相同的Pst Ⅰ片段杂交,位于这一片段上的2．1kb sma Ⅰ—EcoR Ⅴ片段只能与以硝酸盐为唯一氮源的总RNA杂交,而不能与相同条件下以铵盐为唯一氮源的总RNA杂交,这些结果表明,所克隆到的5,0kb Pst Ⅰ DNA片段含有地中海拟无枝菌酸菌U-3z的硝酸还原酶基因。这是好氧细菌硝酸还原酶基因克隆的首次报道。由该酶蛋白分子量推测,其结构基因大小在1．5kb左右,进一步的杂交分析发现在5．0kb的Pstl片段中含有完整的NR基因。用20种限制酶对重组质粒pJLl进行了限制酶酶谱的构建。发现有10种酶在pJLl外源片段上无切点,6种酶为单切点,EcoR Ⅰ与Sma Ⅰ各有两个切点。     

林可链霉菌中的同源重组

为研究链霉菌中的同源整合频率和机制 ,采用不能在链霉菌中复制的大肠杆菌质粒转化链霉菌StreptomyceslincolnensisB48。质粒pYYE0 4a1上携带的被硫链丝菌素抗性基因灭活的林可霉素生物合成基因与染色体DNA上的同源基因发生重组 ,经过低抗筛选 ,得到两个突变子S .lincolnensisYY1和S .lincolnensisYY2。进一步以硫链丝菌素抗性基因为探针杂交染色体DNASmaⅠ片段 ,S .lincolnensisYY1和S .lincolnensisYY2都得到 1 5kb的阳性条带 ;而以缺失的lacZ基因为探针杂交染色体DNAHindⅢ和SmaⅠ联合酶切片段 ,只有S .lincolnensisYY2得到 4 4kb的阳性条带。Southern杂交结果表明S .lincolnensisYY1是由同源交换或二次重组产生的 ,而S .lincolnensisYY2为同源整合的结果。为验证同源整合子上大肠杆菌复制子和氨苄抗性基因的存在 ,用SphⅠ酶切染色体DNA后连接 ,连接液转化E .coliJM83感受态细胞 ,在氨苄抗性板上得到 2个转化子 ,命名为pSLE1。对…     

麦迪霉素生物合成基因克隆研究

利用穿梭粘粒载体pNJ1组建了麦迪霉素产生菌Streptomyces mycarolaciens 1748的基因文库,用与麦迪霉素生物台成有类似途径的放线紫红素聚酮合成酶基因Act I,Act Ⅱ为探针,从麦迪霉素产生菌的基因文库中,获得了与ActI,Act Ⅱ基因有同源性的阳性克隆,对其中PCNSBl2、6C5及11E11克隆DNA进行了酶切分析,其分子量分别为36kb,48．5kb及41．6kb。PCN6C5 DNA中包含有PCN 8B32的全部DNA片段,PCN ⅡEⅡ与PCN 8B12及PCN 6C5有6．75kb的重叠区。通过分子杂交实验,初步将麦迪霉素聚酮台成酶基因定位在PCN 8812 DNA的EcoR I—BamH I 4．02kb片段上(与Act Ⅱ基因有同源性)及PCN 8B12(6C5),PCNIIEIIDNA BgⅡ—BgⅡ 2．42kb与PCNllE11 Bgl I—B g1 I 1Okb片段上(与Act I基因有同源性)。PCN 8B12及PCN 6C5克隆DNA在麦迪霉素聚酮合成酶基因缺陷型变株Streptomyces mycarofaciens var．68及不产抗生索的变铅青链霉菌Streptomyces lividans TK24受体菌的表达产物,经TLC及HPLC等分析表明与麦迪霉素标准品相似。     

大肠杆菌葡萄糖异构酶基因在变铅青链霉菌中的克隆与表达

本文用穿梭质粒载体pSE-3,进行了大肠杆菌葡萄糖异构酶基因在变铅青链霉菌中的克隆与表达。把含有1.6kb葡萄糖异构酶基因的pX1200(4.3kb)质粒与pGEM-3(2.9kb)质粒分别用EcoRI酶解,T4DNA连接酶连接,转化E.Coli HB101(Xy1~-,Neo(?)),得到的重组质粒被命名为pX1203(7.2kb);将pX1203与穿梭质粒载体pSE-3分别用HindⅢ酶解,T_4DNA连接酶连接,转化E.Coli HB101,在含有新霉素的木糖培养基上筛选到转化重组体,其重组质粒被命名为pSE×100(10.6kb);把pSE×100转化变铅青链霉菌TK54的原生质体,在硫链丝菌肽(50μg/ml)和新霉素(50μg/ml)的平皿上得到了重组体。经质粒提取,酶切分析,再转化和葡萄糖异构酶活性测定,结果表明,大肠杆菌的葡萄糖异构酶基因确实已在链霉菌中克隆和表达。     

霍乱肠毒素基因在大肠杆菌中的克隆与表达

霍乱弧菌569B染色体DNA,经毒源性大肠杆菌不耐热毒素基因探针定位,确定霍乱毒素基因分别位于EcoRI/pst I 酶解的5.1和5.4kb片段。我们分离其EcoR I/Pst I 酶解的4.5—6．0kb片段,与经EcoR I／Pst I 酶解的质粒pBR322体外连接转化大肠杆菌,经原位菌落杂交及重组质粒DNA的电泳分析鉴定,获得了霍乱毒素基因的克隆。通过生物活性和抗原性测定,表明霍乱毒素基因在大肠杆菌中获得了表达。     

7号淀粉酶链霉菌M1033木糖异构酶基因的启动子活性检测、转录起始点的确定

分别从重组质粒ｐＵＢ１及其Ｍ（１３）亚克隆Ｓ１中将７号淀粉酶链霉菌（ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓＮｏ．７）Ｍ１０３３（以下简称Ｓ．ｄｉ．Ｍ１０３３）木糖异构酶基因的－１９２－＋５８１ｂｐ片段克隆入链霉菌启动子探测质粒ｐＩＪ４０８３中,转化变铅青链霉菌（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ２４。通过对其邻苯二酚加双氧酶活性的检测表明,该片段具有启动子活性。应用Ｍ１３亚克隆Ｓ１和合成引物Ｐ６延伸制备放射性标记的单链ＤＮＡ探针;通过Ｓ．ｄｉ．Ｍ１０３３的总ＲＮＡ的Ｓ１核酸酶保护实验,确定了其转录的起始位点,并由此探讨了与木糖异构酶基因表达有关的一些因素。     

圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成基因：—sanJ的克隆及功能研究

以尼可霉素生物合成相关的基因片段为探针,从圈卷产色链霉菌cosmid基因文库中筛选到１个大约７．５kb的ＤＮＡ片段,交ＤＮＡ片段克隆到载体pBluescripM13-的KpnⅠ位点,得到了重组质粒pNL2200.对pNL2200中外源ＤＮＡ片段进行了一系列的亚克隆及部分核苷酸序列分析。结果表明,２．３kb的SalⅠ－ＢaｍＨⅠＤＮＡ片段中含有１个完整的开放阅读框,起始密码子为２７１位的ＧＴＧ,终止密码子为１９５４位的ＴＧＡ,该基因的大小为１６８６bp,编码１个大小为５６１个氨基酸的蛋白质产物。利用blastx程序的蛋白质数据库中进行同源比较,结果揭示此基因产物与腺苷酸形成酶超家族的连接酶有４４％的一致性,此外,该基因的破坏导致圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成能力的丧失,证明它是尼可霉素生物合成所必需的,命名为其为sanＪ。     

生米卡链霉菌变株丙酰化酶基因的克隆和表达

麦迪霉素产生菌生米卡链霉菌(streptomyces mycarofaciens)变株具有丙酰化酶活性,可以将螺旋霉素转化为丙酰螺旋霉素。为了进行丙酰化酶基因克隆,本实验以质粒pIJ702为载体通过鸟枪克隆法将变株DNA片段克隆至变铅青链霉菌TK54(Streptomyces livdansTK54),经薄层层析和高压液相色谱分析结果表明,在转化子中,N0．9菌株可以将螺旋霉素转化为丙酰螺旋霉素,这证明丙酰化酶基因已在变铅青链霉菌TK54中克隆并得到初步表达,№．9重组质粒插入DNA片段为4．16kb,经southern杂交表明确实来源于变株。此外还构建了N0．9重组质粒的限制酶酶切图谱。     

林可链霉菌黑色素生物合成基因的克隆与表达

以pIJ702的melCl－C2基因为探针杂交林可链霉菌（Streptomyceslincolnensis）78－11染色体DNA,呈现出3．2kb的BamHI片段和2．6kb的SphI片段等一系列阳性条带。构建了含3．0～3．5kbBamHI片段的林可链霉菌78-11基因文库,从中分离克隆了黑色素生物合成基因melCl和melC2,并测定了含有mel基因的重组子pRSB336插入片段的全部DNA顺序。3152bpBamHI片段含有5个开放阅读框架,其中melCl和melC2与链霉菌属三个种的相应基因具有较高的同源性。此外,林可链霉菌78－11的melC2基因产物与人和鼠的酪氨酸酶轻微同源,分别为17．3％和24．5％。种种迹象表明,melCl、melC2和orf3组成黑色素生物合成操纵子结构。为了进一步鉴定上述克隆的林可链霉菌78-11黑色素生物合成基因,构建了分别含有新霉素抗性基因启动子和正反方向mel基因的重组质粒pPZ518和pPZ519,并转化变铅青链霉菌TK23。随机挑选的12个pPZ518转化子在R2YE培养基上均能分泌淡褐色色素,而所有的pPZ519和pES1转化子则都呈白色。     

紫云英根瘤菌共同结瘤基因nodA和nodBC的核苷酸序列

以~(32)p标记的苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)2.3kb nod DNA作探针,从紫云英根瘤菌(Rhizobium huakuii即R. astragali)159基因文库中分离到一株能与探针DNA呈阳性反应的克隆pRaN109。同源DNA-DNA杂交及DNA序列分析表明:pRaN109DNA的9kb EcoRI片段上携带了nodD_1BC基因,pRaN109 NDA的18kb EcoRI片段上携带了nodD_2A基因。共同结瘤基因nodA与nodBC两者相距6.7kb。在nodA基因和nodBC基因的上游都存在有结瘤盒(nod box)。与来自不同种属的菌株所报告的结果相比较,紫云英根瘤菌159中的共同结瘤基因有着明显不同的组合。     

圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成基因sanK的克隆及功能研究

利用染色体步移策略,以尼可霉素生物合成相关的基因片段为探针,从圈卷产色链霉菌中克隆到了一个大约10kb的DNA片段。对其中1.8kb的PvuII-SacII片段进行了序列分析,结果表明：此片段中含有一个具有1170个核苷酸的完整开放阅读框,起始密码子为447位的ATG,终止密码子为1614位的TGA,推测其编码一个389个氨基酸的蛋白质产物。利用BLASTX程序进行的分析揭示,此基因编码一个肌氨酸单体氧化酶。基因功能研究结果表明,此基因与圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成直接相关,命名为sanK。     

大肠杆菌D－木糖异构酶基因的序列分析

大肠杆菌D-木糖异构酶基因由含D－木糖操纵子的质粒px0100被克隆到pwRl3质粒上。以Bal31核酸酶逐步缩短DNA片段的方法,获得了若干个含有不同大小DNA片段的亚克隆,并在质粒上直接测定序列,从中获得了1．6kbDNA片段的核苷酸全序列。其中包括长度为1320bp编码440个氨基酸的蛋白质。此外,在其5’端尚有209个核苷酸和3’端82个核苷酸,它们分别含有核糖体结合位点SD序列和D－木糖异构酶基因转录终止区。     

麦迪霉素4"-O-丙酰基转移酶(mpt)基因结构的研究

对含有麦迪霉素4"-O-丙酰基转移酶(mpt)基因的BamHI-BamHI 8.0kb的DNA片段进行限制性酶切分析,绘制出了含有21个酶切位点的限制性酶切图谱。以含有碳霉素异戊酰基转移酶基因(CarE)的2.4kb DNA片段为探针,经Southern blot分子杂交,将mpt定位于一个EcoRI-EcoRI-Pstl 3.0kb的DNA片段上,将该片段克隆至大肠杆菌/链霉菌穿梭质粒载体pWHM3上,获得重组质粒pWFPE。含有pWFPE的螺旋霉素产生菌产二素链霉菌(S.ambofaciens)及变铅青链霉菌(J.lividans)TK24均可将内源产生的或外源加入的螺旋霉素酰化为4"-O-丙酰螺旋霉素。对EcoRI-EcoRI-PstI 3.0kbDNA片段上mpt基因进行序列分析,在该片段上有一个开放阅读框架,它以ATG为起始密码子,以TGA为终止密码子,与其序列对应的编码产物含有388个氨基酸。Mpt基因的G+C mol％为68.0,密码子第三位上G+C mol％为91.5。Mpt基因编码的氨基酸序列与CarE基因编码的氨基酸序列的相同性为67.6％,相似性为86.4％。在起始密码子上游6bp处存在…