鹅源腺病毒基因组DNA物理图谱的构建

将鹅源腺病毒Y81G4株全基因组DNA的HindⅢ酶切片段分别插入质粒pUC18, 成功构建了全基因组DNA文库.在此基础上,将重组质粒携带的插入片段切出、回收并分别用地高辛标记后作为探针,与经限制酶BamHI、EcoRI、PstI、Eco RV消化的病毒基因组DNA进行Southern Blotting,杂交结果经比较综合后获得了该病毒基因组DNA的HindⅢ、Ba mH I、EcoR I、PstI、EcoR V限制性内切酶的物理图谱.利用已发表的含有鸡EDS76病毒AA-2 株基因组DNA右末端的重组质粒pBE42作为探针,与本病毒两末端重组质粒进行Southern Blo tting,根据同源性杂交结果确定了本病毒基因组DNA物理图谱与EDSVAA-2株相应的方向. 本病毒基础因组DNA物理图谱的精确构建,为进行基因组结构分析,筛选复制非必需区,构建禽腺病毒载体打下了基础.     

I型马立克氏病毒38kD磷蛋白与Ⅱ和Ⅲ型病毒间的交叉免疫反应

由致病性Ⅰ型马立克氏病病毒(MDV)特异性的单克隆抗体H_(19)制备亲和层析柱,从感染重组杆状病毒BP38Ⅱ的昆虫细胞系Sf9细胞中提纯MDV的pp38基因表达产物,以此免疫小鼠制备抗血清,测定其与不同型MDV毒株感染的鸡胚成纤维细胞免疫反应性,同时也用不同型MDV毒株(HVT,Z4)制备的抗血清和自然感染发病鸡血清分别与感染重组病毒的Sf9细胞进行免疫交叉反应.试验结果表明,完整的Ⅰ型MDV来源的pp38基因产物与所试Ⅱ型Z4株和Ⅲ型HVT Fc126毒株在抗原性上有显著交叉反应.这一结果表明,在Ⅱ型和Ⅲ型MDV毒株中可能存在着pp38的类似物.     

用PCR扩增和克隆鸡传染性贫血病毒全基因组DNA

根据已发表的序列,分别在鸡贫血病毒(CAV)环形基因组DNA(全长2.3kb)的EcoRI位点和BamHI位点的两侧选择适当序列合成两对引物,用PCR技术,从斑点杂交检测到病毒核酸的CAV感染的MDCC-RP1细胞基因组DNA中,分别扩增出包含EcoRI和BamHI分割开的病毒基因组两部分(1.5kb和0.8kb)约1.5kb和约1.25kb的两个片段.再将其中相应序列拼接克隆进pUC18载体,获得包含CAV全基因组序列DNA片段的克隆质粒pCAV2.4.酶切分析表明,该质粒具有预期的BamHI位点、PstI位点、HindⅢ位点,而预期的EcoRI位点消失.重组质粒插入DNA片段的两端序列分析表明,质粒pCAV2.4是包含CAV全基因组序列的重组质粒,插入DNA片段序列中的EcoRI位点序列发生了一个碱基突变.     

由反转录病毒载体转移的马立克病毒糖蛋白D基因在感染细胞中的表达

用ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ将已分离和克隆的马立克氏病病毒糖蛋白Ｄ基因从重组ｐＭｇＤ１８质粒中切出,克隆进反转录病毒质粒载体（ＲＣＡＳ）的连接质粒载全ＰＵＣＣｌａ１１２Ｎ的相同位点。用ＣｌａＩ再次ｇＤ基因切出,构建于ＲＣＡＳ的ＣｌａＩ位点。通过原位杂交筛选重组ＲＣＡＳ,并结合酶切分析鉴定出ｇＤ插入方向正确的重组ＲＣＡＳ。用磷酸钙沉淀法将ｇＤ重组ＲＣＡＳ转染鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）,转染后第９天收集细胞上     

用PCR扩增和克隆马立克氏病病毒糖蛋白D基因

用ＰＣＲ技术,从ＧＡ株马立克氏病病毒（ＭＤＶ）感染的成纤维细胞（ＧＥＦ）基因组ＤＮＡ中扩增出ＭＤＶ糖蛋白Ｄ（ｇＤ）抗原基因片段的约１３００ｂｐ编码序列,将该ｐｃＲ扩增的产物于ＥｃｏＲＩ和Ｋｐｎｌ位点克隆到ｐＵＣ１８质粒载体中,在以ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ（ｄｉｇ）标记的ｇＤＰＣＲ产物作为探针,进行原位杂交初步筛选到阳性重组质粒克隆,再根据酶切分析筛选到含ＭＤＶｇＤ基因的重组质粒ｐ１８ＭｇＤ。将ｐ１８ＭｇＤ质粒ＤＮＡ用ｄｉｇ标记后,在Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ中,该探针能识别ＭＤＶ基因组ＤＮＡ的ＢａｍＨＩ－Ａ克隆中的Ａ片段ＤＮＡ。酶切位点分析表明,该ｇＤ克隆也和已发表的ＭＤＶ的ＲＢＩＢ株ｇＤ一样,不含有ＥｃｏＲⅠ、ＨｉｎｄⅢ、ＰｓｔⅠ、ＳｍａⅠ、ｐｖｕⅡ等酶切位点。证明该重组质粒是ＭＤＶｇＤ克隆。     

鸡贫血病毒VP1基因在大肠杆菌中的高效表达及其生物学特性的初步分析

将鸡贫血病毒(CAV)VP1蛋白449个氨基酸中的424个氨基酸(占95%)编码序列分二段,分别克隆入表达性载体pGEX-5X-3,在大肠杆菌以GST融合蛋白的形式获得了高效表达.以表达产物免疫小鼠4次,制备了抗CAV的多克隆抗体.通过对CAV感染的MSB1细胞做间接免疫荧光试验(IFA),结果为阳性.这表明表达物保留了天然VP1相关的抗原性.用此抗CAV抗体和所建立的IFA方法对临床CAV凝似病料成功地进行了实验室诊断.