Ensted double PCR法对献血者血浆中HCV—RNA的检出—兼评作为献血筛选试验的Anti—HCV抗体检查

本文报道了在位于5′端非编码区的引物的诱导下用Nested double PCR技术检测献血者血浆中HVC－RNA的方法。我们发现Nested double PCR敏感性及特异性均优于单次PCR。anti-HCV(H100-3)阳性血浆样品中只有35．2％（19／54）能同时被证实为PCR阳性。由于anti-HVC(C100-3)假阳性率太高，作为献血筛选试验检测方法不能令人满意，而本文报导的Nestel double PCR方法可以弥补anti－HVC试验的不足。     

检测猪粪便中基因4型戊型肝炎病毒的实时荧光定量RT-PCR方法的建立

针对基因4型戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)基因组ORF3设计特异性引物和探针,建立了一套TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法。评价了该方法的准确性和灵敏性,同时与常规RT-PCR和巢式RT-PCR方法进行了对比分析。结果表明,生成的标准曲线显示各浓度范围内具有良好的线性关系,相关系数(r2)为0.994,斜率为-3.312,PCR效率为100%。组内和组间重复性试验相同稀释度标准质粒Ct值之间差异均不显著,并且能够准确的从HEV阳性猪粪便样品中检测到基因4型HEV RNA,具有较好准确性。可检测到戊型肝炎病毒数量为(1.7×101)copies,比普通RT-PCR的灵敏度高100倍,比Nested RT-PCR高10倍。     

PCR技术在猴免疫缺陷病毒(SIV)感染模型中的应用

目的(1)建立RT PCR方法,定性测定SIV感染猴血浆中病毒RNA,比较其与传统血浆病毒分离方法的敏感性;(2)建立DNA PCR方法,检测SIV感染猴外周血淋巴细胞(PBMCs)中的前病毒DNA。(3)检验DNA PCR和RNA PCR方法在猴SAIDS模型应用中的实用性和可操作性。方法用SIVmac251静脉感染恒河猴,定期采血,从血浆中提取病毒RNA,以RNA为模板通过RT PCR法扩增,凝胶电泳定性;从感染猴PBMC中提取带有整合的SIV前病毒DNA的细胞基因组DNA,巢式PCR扩增,凝胶电泳定性。结果DNA PCR和RNA PCR经两轮扩增后均得到一长度为477bp的特异条带,测序鉴定确为目的片段。9只实验猴感染SIV后7d,RNA PCR结果为79阳性,DNA PCR结果为100%阳性,而血浆病毒分离只有59阳性;此后一直到感染后的42d,RNA PCR和DNA PCR的结果一直为100%阳性,而血浆病毒分离阳性率在感染后35d下降到49,到42d时下降为零。结论PCR方法比病毒分离方法的敏感性高。尤其是DNA PCR,既可检测具有活跃病毒复制的受感染细胞,又可检测那些携带病毒处于转录休眠期的细胞,所以在感染的早期和中后期———血浆病毒水平较低的情况下或病毒处于潜伏感染的阶段,它作为猴艾滋病(SAIDS)模型病毒学指标之一有其必要性和重要性。这个指标的检测方法应该是较血浆病毒RNA检测更为敏感。     

玉米细菌性枯萎病及其病原菌的检测技术

玉米细菌性枯萎病是影响玉米生产的重要病害 ,该病害通过带菌的种子进行远距离传播 ,对该病菌的检测成为防止和控制该病害的重要手段。介绍现有的检测该病菌的各种方法 ,即黑色素选择培养法、double sandwichELISA以及RAPD PCR ,LCR PCR ,Nested PCR ,multiplePCR和荧光实时PCR等分子生物学检测方法 ,并对这些方法的特性进行比较和探讨。     

AM真菌DNA的提取与PCR-DGGE分析

分别从丛枝菌根(AM)真菌的单孢、宿主植物根系及土壤样品中提取DNA,对AM真菌的18SrDNA中NS31/Glol区进行Nested PCR特异性扩增,表明Nested PCR能很好地以微量DNA为模板扩增出目标产物;对扩增产物进行DGGE电泳,3种样品表现出不同的DGGE指纹图谱特征。本文认为,将Nested PCR与DGGE技术相结合,可以成为AM真菌分子生态学研究的有效途径。     

丙型肝炎病毒不同标志物检测结果的相关性分析

目的分析丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)抗原、抗体及核酸标志物实验室检测结果之间的关联性,评价适合血源筛查与早期临床确诊联合检测HCV感染的实验室诊断技术。方法用HCV RNA定量试剂、HCV核心抗原试剂及HCV抗体试剂分别检测304份血浆样本中HCV RNA载量、HCV Ag和抗-HCV指标,并对HCV RNA阳性样本进行基因分型。结果在304份血浆样本中,检出HCV RNA阳性样本87份,其HCV RNA载量≥500 IU/m L、500~30 IU/m L之间和<30 IU/m L时,血清学标志物HCV Ag浓度≥3 fmol/L及抗-HCV信号值/判断值≥1的阳性率分别为92.0%(23/25):96.0%(24/25)、58.8%(10/17):82.3%(14/17)及11.1%(5/45):75.6%(34/45),HCV RNA载量低于基因分型试剂盒LOD要求为500 IU/m L时,基因分型检测率为24.2%(15/62)。HCV RNA阴性样本217份中,HCV Ag浓度≥3 fmol/L和抗-HCV信号值/判断值≥1的样本阳性率分别为3.2%(7/217)和32.7%(71/217)。血清学指标在不同HCV RNA载量的阳性率差异具有统计学意义(χ2=197.4,P<0.01),HCV RNA载量与HCV Ag和抗-HCV水平成正相关。结论在中国人群中存在低HCV RNA水平携带者,HCV Ag和基因分型检测能力需要进一步提高。     

基于通用探针库的实时荧光PCR技术快速检测阳性血培养瓶中的细菌病原体

为从阳性血培养瓶中快速检测8种细菌,选取Roche公司通用探针库的锁核酸探针进行基于实时荧光PCR技术的一组试验。为鉴定菌种根据革兰氏染色的结果,对四组靶向于一个革兰氏阳性菌和一个革兰氏阴性菌的双重实时荧光PCR反应进行优化。检测的灵敏度是1-10CFU(菌落形成单位)/PCR反应混合物。试验的特异性和交叉反应由28个来自于ATCC(美国模式培养物集存库)的参考菌株和77种血培养阴性的标本进行鉴定。在这些试验样品中没有观察到交叉反应,因此证明试验100%的特异性。72种此前鉴定过的临床病毒株通过实时荧光PCR技术进行测试,验证实时荧光PCR试验的精确度和可行性。此外,用实时荧光PCR试验55类阳性血培养样本,通过生化分析评价,50(90.9%)类被鉴定为相同物种。实时荧光PCR与传统的方法有98.2%的一致。实时荧光PCR可以用来作为从阳性血培养中早期检测常见病原体方法的补充。     

血浆1,3-β-D葡聚糖检测联合念珠菌评分对侵袭性真菌感染的诊断价值

目的探讨血浆1,3-β-D葡聚糖检测(G试验)和念珠菌评分(CS)对侵袭性真菌感染(IFI)的诊断价值。方法收集2011年6月~2016年6月某院ICU科收治的201例IFI高危患者的病例,按照欧洲癌症研究治疗组及真菌研究组(EORTC/MSG)诊断标准,确诊9例,临床诊断73例,拟诊29例,非感染组90例,应用MB-80微生物动态快速检测系统及配套G试验试剂盒定量检测血浆中1,3-β-D葡聚糖的含量(1,3-β-D葡聚糖含量≥10pg/mL为阳性),并对201例高危患者进行念珠菌评分(评分结果≥3为阳性),计算G试验与CS单独或联合使用敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值。结果 IFI感染部位以呼吸道最常见,致病菌以白念珠菌为主。血浆1,3-β-D葡聚糖检测阳性者有88例,念珠菌评分阳性者有85例。联合使用血浆1,3-β-D葡聚糖检测与念珠菌评分,其灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为:95.1%、71.1%、75.0%、94.1%;相比血浆1,3-β-D葡聚糖检测与念珠菌评分单独使用,其灵敏度、阴性预测值最高,特异度、阳性预测值相近。结论血浆1,3-β-D葡聚糖检测与念珠菌评分联合应用时,灵敏度及阴性预测值均较单独使用增高,联合应用对诊断侵袭性真菌感染意义更大。     

G试验联合GM试验对恶性血液病患者伴侵袭性真菌病的诊断价值研究

目的探讨血浆(1,3)-β-D-葡聚糖检测(G试验)联合血浆半乳甘露聚糖检测(GM试验)对诊断恶性血液病患者伴侵袭性真菌病(IFD)的临床应用价值。方法收集安徽医科大学第一附属医院血液内科高危侵袭性真菌感染(IFI)病例193例,根据患者血浆G试验和GM试验的临床结果,分析其单项和联合检测时在IFD诊断中的敏感性、特异性、阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)。并同时分析GM试验结果在IFD患者治疗过程中的变化趋势。结果在血液肿瘤伴IFD的患者中,单独血浆G试验的检测敏感性、特异性、PPV和NPV分别是71.7%、89.3%、71.7%、89.3%。单独GM试验检测的敏感性、特异性、PPV和NPV分别是54.7%、94.3%、78.4%、84.6%。串联检测(两项同时阳性)的敏感性、特异性、PPV和NPV分别是39.6%、99.3%、95.5%、81.3%。并联检测(两项中任意一项阳性)的敏感性、特异性、PPV和NPV分别是86.6%、84.3%、67.7%、94.4%。17例GM试验阳性患者接受抗真菌治疗后,14例有效,3例无效。治疗有效组血浆GM值均从第2周开始下降,第3周降至正常水平,治疗无效组GM值持续升高,有效组和无效组差异有统计学意义(P0.05)。结论血浆G试验和血浆GM试验对恶性血液病患者伴IFD有较高的临床诊断价值,两者联合检测的临床诊断价值进一步提高,可作为IFI诊断的指标之一;动态监测GM值有利于评估临床抗真菌治疗的疗效。     

检测大鼠血浆游离DNA的定量PCR方法的建立及意义

目的:过度训练是体育界非常重要的问题,目前用多个指标的综合评定来判断是否有过度训练,尚无灵敏、特异的监控指标和简便的评价方法。本文建立检测大鼠血浆游离DNA(cell free DNA,cf DNA)的实时荧光定量PCR方法,并探讨血浆cf DNA水平能否成为反映大鼠过度训练的新监控指标。方法:12只雄性SD大鼠随机分为2组(n=6):安静组和过度训练组。过度训练组进行5周递增负荷的过度训练,每周运动6 d,运动的最后一天运动至力竭。力竭运动后36 h采集静脉血,检测大鼠血浆cf DNA、睾酮(T)和皮质酮(Cort)、总抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)和肌酸激酶(CK)的水平以及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性。结果:1所建立的方法能特异扩增大鼠血浆cf DNA;2与对照组相比,过度训练大鼠的血浆cf DNA水平显著增加(约为安静组的5.43倍);3血浆cf DNA与血浆T、Cort、T/C比值和MDA显著相关(相关系数分别为-0.729,0.854,-0.655和0.720);与T-AOC、GSH-Px、SOD和CK无相关性。结论:1建立检测大鼠血浆cf DNA的定量PCR方法;2过度训练大鼠的血浆cf DNA显著增加,且cf DNA与血浆T、Cort和T/C比值高度相关,提示血浆cf DNA是过度训练的新监控指标;3过度训练大鼠血浆cf DNA的增加可能与过度训练所致的氧化应激增强有关,可能与骨骼肌损伤关系不大。     

圈养小熊猫几种病毒的PCR检测

本文采用巢式PCR/ RT-PCR 方法,对我国10 个动物园中无临床症状的圈养小熊猫的71 个肛拭子和61 个唾液拭子样品,进行犬瘟热病毒(CDV)、犬细小病毒(CPV)、犬冠状病毒(CCV)、犬腺病毒(CAV)和犬疱疹病毒(CHV)的检测,以评估我国圈养小熊猫是否面临这几种病毒的威胁。对阳性PCR 结果进行测序分析,并与GenBank 上的序列进行比较。结果,在肛拭子样品中检测到3 个CPV 和6 个CCV 阳性结果,经测序后,与GenBank 上序列的同源性分别达99% 和100% 。而在唾液拭子样品中没有检测到任何阳性结果,且CDV、CAV和CCV 的检测结果均为阴性。从阳性CPV 的肛拭子样品中分离到一株细小病毒毒株,表明圈养小熊猫已受到细小病毒和犬冠状病毒的感染,今后应加强这两种病毒的预防工作。本文所采用的PCR 方法检测病毒性疾病,能检测到微量的病毒模板,可对小熊猫病毒性感染进行早期诊断。     

用RT-PCR验证抗-HCV C100和抗-HCV CP检测系统的特异性

本文检测了几种人群中HCV C100抗原的抗体(抗-C100)和HCV核心抗原的抗体(抗-CP)的阳性率。输血后NANB肝炎中抗体阳性率最高(抗-C100:58.7％;抗-CP:71.7％),其次为未知病因NANB肝炎(抗-C100:26.2％,抗-CP:38.5％)和血液病人(抗-C100:15.0％,抗-CP:31.7％);而急性散发性肝炎中的抗体阳性率较低(抗-C100:8.9％,抗-CP:15.5％)。成年人中二种抗体阳性率分别为1.8％和2.8％。在各科人群中抗-CP阳性率明显高于抗-C100,表明抗-CP是检测HCV感染的十分有用的指标。同时本文还用RT-PCR法验证了抗-C100和抗-CP检测系统的特异性,发现抗-CP和HCVRNA有良好的相符性,而抗-C100和HCVRNA的相符性较差,因此推测抗-CP检测系统比抗-C100检测系统有较高的特异性。     

检测低拷贝数HBV DNA含量的临床研究

目的:了解不同试剂在应用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)以及巢式PCR方法在检测低拷贝数的HBV DNA量的差异与灵敏度。方法:用上海复星医学科技发展有限公司(A方法)检测出了68例HBV DNA结果为5.1×101-1.0×103拷贝数/亳升的低拷贝数标本。然后,三家不同公司的试剂(方法 B、方法 C、方法 D)对这些样本进行复核。另外,巢式聚合酶链反应PCR法检测此68例标本。随访巢式PCR结果为阳性的10例低拷贝数HBV DNA的病人。结果:用四种方法(A、B、C、D)检测的68个样本的HBV DNA拷贝数结果如下:无拷贝(0,9,12,4);101-102(21,17,18,22);102-103(47,36,28,35),大于103(0,6,10,7)。同时,用巢式聚合酶链反应检测此68例标本,有55例检测为阳性,有13为阴性结果。巢式PCR结果为阳性的10例低拷贝数HBV DNA含量的病人,随访发现此10病人有8例均在1~3月后出现HBV DNA的反跳,并伴肝功能的不正常,其HBV DNA的含量均在104拷贝数/毫升以上。结论:目前所用的实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)的方法和试剂对低拷贝数HBV DNA存在不稳定性和不确定性。巢式PCR法对低拷贝数HBV DNA的检测灵敏度要远高于实时荧光定量PCR法。该研究提示测对抗病毒治疗过程中患者进行低拷贝数HBV DNA的检将提供有效的药物评价和预后信息。     

四种检测沙眼衣原体方法的诊断符合率分析

目的评价直接免疫荧光染色(DFA)、聚合酶链式反应(PCR)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和金标免疫层析试验(GICA)4种方法检测沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,CT)的实验诊断符合率。方法同时采用DFA、PCR、ELISA和GICA4种方法检测临床泌尿生殖道样本CT感染标志物。2种及2种以上方法结果阳性判为真阳性,仅有1种方法结果阳性或全部方法结果阴性则判为真阴性。分别计算4种法的灵敏度、特异性、阳性预测值和阴性预测值、ROC曲线下面积以及各方法之间的Kappa值。结果 223份临床泌尿生殖道标本中阳性32例,阴性191例。DFA、PCR、ELISA、GICA 4种方法的敏感度依次为93.7%、96.8%、90.6%和28.1%,特异性为98.9%、98.9%、98.4%和100%,阳性预测值为93.7%、93.9%、90.6%和100%,阴性预测值为98.9%、99.4%、98.4%和89.2%;ROC曲线下面积为0.964、0.964、0.945和0.641。前3种方法之间Kappa值0.82~0.95,与GI-CA法之间Kappa值均小于0.5。结论 DFA法、ELISA法、PCR法作为临床CT感染的实验室检测是较理想的方法;GICA法因灵敏度低且ROC曲线下面积仅0.641,作为实验诊断方法不太理想。     

口蹄疫病毒结构蛋白P1-2A及蛋白酶3C基因的转基因番茄对豚鼠免疫反应的初步研究

构建了O型口蹄疫病毒China99株结构蛋白P1-2A、非结构蛋白3C以及部分2B基因(P1-2X3C)的植物双元表达载体pBin438/P1-2X3C,通过农杆菌介导法转化番茄子叶,经卡那霉素抗性筛选,获得40余株抗性植株,对得到的抗性植株进行分子生物学检测,65%的再生植株PCR检测阳性;RT-PCR结果证实P1-2X3C基因在转基因番茄中能够有效转录;ELISA和Western blot检测表明转基因植株中表达的目的蛋白具有免疫反应性。转基因番茄叶片蛋白粗提液经肌肉途径免疫豚鼠,于第3次免疫后28d用100ID50/0.2mL的同源强毒攻击,结果表明口蹄疫病毒P1-2X3C基因的转基因番茄表达产物具有良好的免疫原性,豚鼠3免后血清效价可达1:64~1:128,攻毒后两组免疫豚鼠保护率分别达3/5和5/5。     

不同方法检测鸡胴体中沙门菌结果的比较研究

对鸡胴体淋洗液样品进行沙门菌检测,样品经过前增菌和选择性增菌后,分别采用4种不同的方法进行检测,即普通PCR方法、实时荧光PCR方法、免疫学方法(VIDAS)和传统的微生物检验方法。共检测了56份样品,普通PCR检出阳性样品34份,实时荧光PCR阳性样品36份,VIDAS阳性样品28份;PCR和实时荧光定量PCR均无假阳性和假阴性结果。结果显示该3种检测方法均可以用于鸡胴体中沙门菌的快速检测。     

检测低拷贝数HBVDNA含量的临床研究

目的:了解不同试剂在应用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)以及巢式PCR方法在检测低拷贝数的HBV DNA量的差异与灵敏度.方法:用上海复星医学科技发展有限公司(A方法)检测出了68例HBV DNA结果为5.1× 101-1.0× 103拷贝数/毫升的低拷贝数标本.然后,三家不同公司的试剂(方法B、方法C、方法D)对这些样本进行复核.另外,巢式聚合酶链反应PCR法检测此68例标本.随访巢式PCR结果为阳性的10例低拷贝数HBV DNA的病人.结果:用四种方法(A、B、C、D)检测的68个样本的HBV DNA拷贝数结果如下:无拷贝(0,9,12,4);101-102 (21,17,18,22);102-103(47,36,28,35),大于103(0,6,10,7).同时,用巢式聚合酶链反应检测此68例标本,有55例检测为阳性,有13为阴性结果.巢式PCR结果为阳性的10例低拷贝数HBV DNA含量的病人,随访发现此10病人有8例均在1～3月后出现HBV DNA的反跳,并伴肝功能的不正常,其HBV DNA的含量均在104拷贝数/毫升以上.结论:目前所用的实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)的方法和试剂对低拷贝数HBV DNA存在不稳定性和不确定性.巢式PCR法对低拷贝数HBV DNA的检测灵敏度要远高于实时荧光定量PCR法.该研究提示测对抗病毒治疗过程中患者进行低拷贝数HBV DNA的检将提供有效的药物评价和预后信息.     

怀孕母鼠外周血中胎儿游离微球蛋白DNA的检测

目的:探索从怀孕母鼠外周血浆中检测胎儿来源的微球蛋白β2m基因的可能性及具体方法。方法:利用β2m基因缺陷的母鼠(β2m-/-)与野生型(WT)或杂合(Heterozygous)雄性小鼠进行杂交,通过巢式PCR(Nest PCR)技术,检测怀孕母鼠外周血浆中不同阶段β2m基因的丰度。结果:证实怀孕母鼠外周血浆中β2m基因丰度与孕期及胎儿数量呈线性关系。     

牛巴氏杆菌病多重PCR检测技术的建立与应用

【背景】牛巴氏杆菌病是由血清型(A、B、E)多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)引起的一种严重危害养牛业的重要传染病,病原学聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)方法是诊断并防控该病的有效手段。【目的】建立检测血清型(A、B、E)多杀性巴氏杆菌的多重PCR方法,为临床诊断牛巴氏杆菌病和病原分型提供技术支撑。【方法】参考多杀性巴氏杆菌hyaD-hyaC基因、bcbD基因和ecbJ基因特异区域,设计3对特异性引物,以温度梯度PCR法确定适宜退火温度(T_m);采用棋盘试验优化引物浓度并初步建立多重PCR方法;采用重组质粒标准品及阳性菌株菌液确定其敏感性(最小检测量);以8种常见牛感染病原体[溶血性曼氏杆菌(Mannheimia hemolytica)C1655、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)C237、产单核细胞李氏杆菌(Listeria monocytogenes)C1597、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)C3053、都柏林沙门氏菌(Salmonella dublin)C79351、副结核分枝杆菌(Mycobacterium paratuberculosis)C1625、牛传染性鼻气管炎病毒(bovine infectious rhinotracheitis virus)CAV1546和牛支原体分离株(Mycoplasma bovis)C65-1]核酸样本确定其特异性;制备3批诊断试剂,对敏感性和特异性样品进行批间和批内试验,确定其重复性;运用建立的方法使用3种不同型号的PCR仪检测敏感性和特异性样品,确定其适用性;通过检测临床样本及人工模拟感染样本评价临床应用效果。【结果】在T_m为55℃时,3对引物浓度分别为0.25、0.30和0.20μmol/L条件下建立多重PCR方法较优,可以同时检测多杀性巴氏杆菌血清A型(821bp)、血清B型(203bp)和血清E型(363bp);该方法敏感性高,对重组质粒标准品pMD-A、pMD-B和pMD-E检测限分别为43.080、3.710和4.350copies/μL,对阳性菌液最低检出限均为10²CFU细菌;其特异性强,仅对血清型(A、B、E)多杀性巴氏杆菌有特异性扩增条带,同时对其他病原体均无扩增条带;该方法重复性良好,批间与批内试验均一致;临床样本及人工模拟感染样本检测结果显示与病原分离鉴定符合率为100%。【结论】成功建立了一种可鉴定不同血清型的牛多杀性巴氏杆菌多重PCR检测方法。     

凝血因子IX基因剔除小鼠的遗传及血液学指标检测

目的　鉴定凝血因子IX基因剔除小鼠。方法　采用PCR扩增检测小鼠的DNA样品以及采用一期法检定小鼠血浆FIX活性和血浆凝血酶原时间 (plasmaprothrombintime ,PT)、白陶土部分凝血活酶时间 (Kaolinpartialthromboplastintime ,KPTT)值。结果　小鼠PCR检测为阳性 ,FIX活性 <5 %。结论　凝血因子IX基因剔除小鼠能稳定遗传 ,鉴定结果提示该小鼠符合人血友病B相应临床症状。