链球菌病类活疫苗活菌计数参考品的研制

研制链球菌病类活疫苗活菌计数参考品,可以更加科学地评价活菌计数结果的准确性和有效性。首先,制备了一批链球菌病类活疫苗活菌计数参考品,对其物理性状、纯粹性、真空度、剩余水分进行检验,并对其均一性、运输稳定性、热稳定性进行测定,另组织3家单位通过协作标定的方式对参考品活菌数进行赋值,用协作标定法统计参考品在12个月内的保存期。参考品的性状检查、纯粹检验、真空度测定和剩余水分测定结果均符合《中国兽药典》的规定;均一性试验结果显示,参考品计数结果的变异系数小于10%,均一性良好;运输稳定性试验证明,参考品在夏季和冬季用泡沫盒加冰袋的方式运输3日内数值仍能保持稳定;加速热稳定性试验验证,参考品在–20 ℃条件下保存3个月、4 ℃条件下保存21 d内均可活菌数稳定;通过协作标定,统计出参考品活菌数的赋值范围为 (8.5–12.1)×107 CFU/支;保存期试验结果证实,参考品在–70 ℃以下保存一年内活菌数可维持稳定状态。链球菌病类活疫苗活菌计数参考品,不仅可以为链球菌病类活疫苗的活菌计数实验提供参照物,而且可以用于评价马丁琼脂培养基的质量,为兽用生物制品质量控制提供保障。     

猪胞内劳森菌感染的免疫应答与检测技术研究进展

胞内劳森菌(Lawsonia intracellularis, LI)常引起猪精神不振、食欲减退、血样下痢或突然死亡,严重损害养猪业。猪群感染该菌在肠道诱导免疫应答的研究较少。因该菌胞内寄生,基于细菌不同感染阶段动物免疫应答特点,检测方法会有所侧重。本文重点阐述了胞内劳森菌感染后机体免疫应答的特点,并对其检测技术进行综述,以期为新型检测技术研发及疫病防控提供参考。     

牛巴氏杆菌病多重PCR检测技术的建立与应用

【背景】牛巴氏杆菌病是由血清型(A、B、E)多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)引起的一种严重危害养牛业的重要传染病,病原学聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)方法是诊断并防控该病的有效手段。【目的】建立检测血清型(A、B、E)多杀性巴氏杆菌的多重PCR方法,为临床诊断牛巴氏杆菌病和病原分型提供技术支撑。【方法】参考多杀性巴氏杆菌hyaD-hyaC基因、bcbD基因和ecbJ基因特异区域,设计3对特异性引物,以温度梯度PCR法确定适宜退火温度(T_m);采用棋盘试验优化引物浓度并初步建立多重PCR方法;采用重组质粒标准品及阳性菌株菌液确定其敏感性(最小检测量);以8种常见牛感染病原体[溶血性曼氏杆菌(Mannheimia hemolytica)C1655、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)C237、产单核细胞李氏杆菌(Listeria monocytogenes)C1597、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)C3053、都柏林沙门氏菌(Salmonella dublin)C79351、副结核分枝杆菌(Mycobacterium paratuberculosis)C1625、牛传染性鼻气管炎病毒(bovine infectious rhinotracheitis virus)CAV1546和牛支原体分离株(Mycoplasma bovis)C65-1]核酸样本确定其特异性;制备3批诊断试剂,对敏感性和特异性样品进行批间和批内试验,确定其重复性;运用建立的方法使用3种不同型号的PCR仪检测敏感性和特异性样品,确定其适用性;通过检测临床样本及人工模拟感染样本评价临床应用效果。【结果】在T_m为55℃时,3对引物浓度分别为0.25、0.30和0.20μmol/L条件下建立多重PCR方法较优,可以同时检测多杀性巴氏杆菌血清A型(821bp)、血清B型(203bp)和血清E型(363bp);该方法敏感性高,对重组质粒标准品pMD-A、pMD-B和pMD-E检测限分别为43.080、3.710和4.350copies/μL,对阳性菌液最低检出限均为10²CFU细菌;其特异性强,仅对血清型(A、B、E)多杀性巴氏杆菌有特异性扩增条带,同时对其他病原体均无扩增条带;该方法重复性良好,批间与批内试验均一致;临床样本及人工模拟感染样本检测结果显示与病原分离鉴定符合率为100%。【结论】成功建立了一种可鉴定不同血清型的牛多杀性巴氏杆菌多重PCR检测方法。     

禽分枝杆菌对豚鼠的致病性分析

【背景】我国禽型结核菌素(avian tuberculin)的制造用菌株为CVCC 68201、CVCC 68202和CVCC 68203株,但目前仍未明确这3株菌的生物学特性及对豚鼠致病性的情况。【目的】探究禽分枝杆菌(Mycobacterium avium)的生物学特性及对动物机体的致病性,为禽结核病和牛结核病的防控工作提供技术支撑。【方法】对3株禽分枝杆菌基因组进行鉴定分析及核酸相似度分析;用3株禽分枝杆菌分别感染豚鼠,观察感染后的临床症状、病理学变化、体重增重情况分析、皮内变态反应结果、脏器系数变化等,进而分析3株禽分枝杆菌对豚鼠的致病力。【结果】种型鉴定和进化分析结果表明,CVCC 68201、CVCC 68202和CVCC 68203均为禽分枝杆菌,基因组与Mycobacterium avium subsp. avium FDAARGOS_1608最为相近;在感染前期、中期、后期对3株禽分枝杆菌感染豚鼠的体重增重情况分析发现,感染禽分枝杆菌影响豚鼠增重,主要表现为生长迟缓,感染第5周时,CVCC 68201、CVCC 68202组豚鼠的平均体重明显轻于未感染组;皮内变态反应试验结果显示,感染CVCC 68201组豚鼠的皮肤红肿面积明显大于其他2个感染组,CVCC 68201可引起机体更为强烈的迟发型变态反应;3株禽分枝杆菌感染后,豚鼠脾脏和肺脏存在不同程度的肿大与出血,其中感染CVCC 68201豚鼠的肺脏系数与未感染组相比差异显著(P<0.01);病理学观察结果显示,豚鼠肺脏可见不同程度病变,其中CVCC 68201组更为严重,表现为肿大和轻微出血。各感染组豚鼠肺脏和脾脏组织切片抗酸染色均可见红色的分枝杆菌散在浸润。【结论】3株禽分枝杆菌对豚鼠均有一定程度的致病性,可引发局部病变。本研究为禽分枝杆菌的制备和鉴定提供依据,也为牛结核病的鉴别诊断方法研究提供参考。