翘嘴鳜线粒体DNA细胞色素b基因序列分析

测定了翘嘴鳜（Siniperca chuatsi）的线粒体细胞色素b基因编码区全序列1140个核苷酸序列,并且由此推导出对应的氨基酸序列,A/T所占比例为53.4％,G C约占46.6％。该基因中密码子第1位核苷酸中4种碱基组成较为均衡,第2位核苷酸中T的使用率较高,G的使用率较低;而密码子第3位C/A的使用率高,而G的使用率仅为3.7％;在氨基酸序列中Leu所占比例16.36％,远高于其它氨基酸;而Cys使用比例仅为0.79％。本研究为鳜类的系统发育,资源保护和利用提供了核苷酸序列方面的资料,至于翘嘴鳜线粒体细胞色素b基本序列中密码子不同位置碱基使用比率以及氨基酸组成是翘嘴鳜特有还是鳜类共有特征,尚有待进一步研究。     

实验动物恒河猴朊病毒基因分析

目的　通过对拟应用于航天飞船模拟试验的实验动物恒河猴进行朊病毒基因检测和分析 ,了解其朊病毒疾病易感性 ,进而为该试验所用实验动物质量提供朊病毒疾病的遗传数据。方法　根据已报道的猴朊病毒基因序列设计引物对 ,采用PCR方法扩增恒河猴朊病毒基因 ,将其克隆到T—VECTOR ,序列测定及分析。结果　序列测定及分析表明所克隆的恒河猴PRNP基因片段为 76 2bp ,该基因内无内含子 ,包含了PRNP完整编码区序列 ,编码 2 5 3个氨基酸的前体蛋白 ,推测其相对分子质量约 2 7 6× 10 3。与已报道的猴的相应序列作比较 ,核苷酸序列同源性分别为 95 %以上 ,其编码的氨基酸同源性均为 95 %以上。其中发现了已报道的多态性位点N97S ,H10 0N和未曾见报道的Q5 2E点突变位点 ,以及沉默突变位点A78G ,T84C ,T4 95C ,A5 6 4G ,C6 5 4 ,未发现与朊病毒敏感性连锁的氨基酸多态位点P10 2L、M12 9V ,N171S和E2 19K。结论　航天医学实验所用 17只恒河猴不存在朊病毒敏感性基因。     

高糖土壤微生物宏基因组文库的构建及β-葡萄糖苷酶基因鉴定

采用宏基因组技术构建了高糖土壤微生物的DNA文库,该文库约含9万个克隆,文库外源DNA总容量为3.1×10~9bp。利用活性筛选策略,对文库进行筛选,获得11个β-葡萄糖苷酶的阳性克隆,并对其中2个表达β-葡萄糖苷酶的克隆进行亚克隆和序列分析,获得两个编码新型β-葡萄糖苷酶的基因分别命名为:unbgl3A和unbgl3B。生物信息学分析表明:unbgl3A基因由2241个碱基对组成,unbgl3B基因由2292个碱基对组成。在核苷酸水平上,unbgl3A、unbgl3B与已知数据库中的β-葡萄糖苷酶基因没有任何相似性。在氨基酸水平上,与GenBank数据库中已知β-葡萄糖苷酶的相似性分别为73%和69%。     

DNA池快速筛查牛STAM1基因SNPs及估算等位基因频率

目的:旨在对不同牛种STAM1基因进行SNPs筛查,为地方牛种选种选育提供一定理论依据.方法:选取生长发育性状明显差异的务川黑牛和贵州荷斯坦奶牛2个牛种构建DNA池,设计1对引物分别扩增2个牛种STAM1基因第14外显子序列总长898bp.切胶回收后对PCR产物进行双向测序.结果:在牛STAM1基因中快速筛查到5个SNPs:A33C、C66G、C356T、T523A、T652C,其中A33C(Tyr→Ser)、C66G(Pro→Arg)、C356T(Glu→Lys)为错义突变,T523A为同义突变,T652C位于内含子区.贵州荷斯坦奶牛在T523A和T652C两个位点基因频率为1.0000,而务川黑牛分别为0.6730和0.8106.生物信息学分析表明:突变前后STAM1的RNA二级结构和蛋白质二级、三级结构均有明显改变.结论:DNA池结合测序技术可快速筛选SNP位点,检测到STAM1基因第14外显子5个SNPs.     

拟穴青蟹线粒体COI基因序列克隆及SNPs位点分析

根据拟穴青蟹(Scylla paramamosain)线粒体全序列设计引物,采用PCR产物双向测序法,克隆了线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COI)基因部分序列(761 bp),并筛选、分析了拟穴青蟹的SNPs位点.共分析了采自福建省宁德市的16只拟穴青蟹,另外,从GenBank数据库中下载了31条前人提交的拟穴青蟹COI基因序列(长度在425-522 bp之间).利用MEGA 4.0软件对所有序列进行比对分析,结果表明碱基T、C、A和G的平均含量分别为37.6％、17.8％、28.9％和15.7％,G+C的含量平均为33.5％.分析结果表明,在所克隆的761bp的COI基因序列中共发现29个SNPs位点,其出现频率为3.8％.在这29个SNPs位点中,13个为C/T转换(占44.8％),12个为A/G转换(占41.4％),2个为A/T颠换(占6.90％),1个为G/C颠换(占3.45％),另有一个位点(201 bp处)发生了A/C颠换和C/T转换两种类型的碱基替换.氨基酸分析表明,在29个SNPs位点中,有9个位点属于非同义突变,引起了氨基酸的变化;其他20个位点属于同义突变,未引起氨基酸的变化.这将为拟穴青蟹遗传背景和群体遗传多样性研究提供新的分子标记.     

DNA改组技术提高低温脂肪酶Lip98热稳定性

[目的]提高来源于海洋微生物的低温脂肪酶Lip98的热稳定性。[方法]采用DNA改组技术进行低温脂肪酶的基因改造,连接到表达载体p ET-28a中构建小突变文库。经过活性筛选产酶重组菌株。在96孔板中进行两轮热稳定筛选突变株。[结果]经过2轮筛选,获得了两个突变株P92A和I199F。其突变位点分别是274位的C变成了G和595位的A变成了T。突变株50℃下的半衰期从24 min分别延长到38 min、85 min。[结论]DNA改组有效提高Lip98的热稳定性,半衰期提高到1.5~3.5倍,为酶的分子改造提供理论依据。     

野猪、家猪及野家杂种猪Leptin基因2、3外显子的SNPs分析

Leptin是一种内分泌激素（167个氨基酸）,主要在脂肪组织中表达,通过下丘脑对机体内能量的消耗和摄取起着重要的调节作用^[1]。鉴于此本文对野猪、家猪及野家杂种猪Leptin的2、3外显子进行了SNPs分析,并检测到了多态性。对纯合子片段进行克隆和测序,结果表明在编码区的214位碱基由T突变为C,编码的氨基酸没有发生改变;364位碱基由C突变为G,365位碱基由G突变为C,编码的Arg转变为Ala;426位由G突变为A,编码的氨基酸没有发生改变;451位插入碱基T,造成移码突变;462位由G突变为T。     

人前列腺癌细胞系PC-3中PTI-1 cDNA的克隆及序列分析

为获取人前列腺癌诱导基因家族新成员 ,以人前列腺癌细胞系PC 3的总RNA为模板 ,用RT PCR方法扩增人前列腺癌诱导基因 1(PTI 1) ,将其亚克隆至克隆载体pUC19,进行测序 .将克隆得到的PTI 1基因片段与国外报道的人PTI 1基因编码区cDNA同源性为 99.3% ,但第 72 6、74 6、116 7、12 70、132 6、144 9、16 94和 16 95位碱基分别由A、A、C、C、A、A、T和C替代了文献中的C、C、G、G、G、C、C和T .其中 6个碱基的不同 ,导致了第 36、183、2 17、2 36、2 77和 35 9位密码子代表的氨基酸分别由Lys替代Gln ,Arg替代Gly ,Ala替代Gly ,Ser替代Gly ,Thr替代Pro和Arg替代Cys .将所获得的基因在GenBank登录 ,登录号为AF3974 0 3.结果提示 ,获得了PTI 1家族新成员 ,并且与EF 1α分子的同源性较已报道的PTI 1高 .     

辽宁省1997～2014年H1a基因亚型麻疹野病毒流行株血凝素(H)基因特征分析

了解辽宁省1997~2014年流行麻疹野病毒血凝素(Hemagglutinin,H)基因特征,为控制和消除麻疹提供依据。本研究选用1997~2014年分离的63株H1a基因亚型麻疹病毒(Measles,MEV),应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分别扩增麻疹病毒(MEV)血凝素(H)基因全长和N基因的450个核苷酸片段,对扩增产物进行核苷酸序列测定和分析。将辽宁省63株MEV序列与GenBank中收录的1993~1994年麻疹病毒H基因型代表株、中国疫苗株沪191(S-191)和长春47(C-47)基于H全长构建基因亲缘性关系树,进行核苷酸和氨基酸变异分析。结果显示辽宁省1997~2014年63株MEV均属于H1基因型的H1a亚型,并分为两个簇(cluster 1和2)。H基因的进化速度低于N基因的进化速度。所有63株MeV在H基因第240位均由丝氨酸(Ser S)突变为天冬酰胺酸(Asn N),在243位由精氨酸(Arg R)突变成甘氨酸(Gly G),第481位由酪氨酸(Tyr Y)突变为天冬酰胺酸(Asn N),另外在397位上cluster 2毒株均由脯氨酸(Pro P)突变成亮氨酸(Leu L),其他具有生物学和免疫学活性的位点未发生改变。     

拟南芥细胞死亡突变体mod1突变座位的精细物理图谱构建

拟南芥细胞死亡突变体mod1突变位点位于第2染色体分子标记IGS1和mi421之间. 以这一区域YAC重叠群中的YAC克隆末端DNA片段CIC9A3R, CIC11C7L, CIC2G5R及RFLP分子标记克隆CDs3为探针筛选TAMU BAC文库, 获得31个阳性BAC克隆. 用BAC克隆的末端DNA片段杂交所有阳性BAC克隆, 确立了由T6P5, T7M23, T12A21, T8L6及T18A18等克隆组成的MOD1基因所在区域的BAC重叠群. 同时在这一区域发展出11个CAPS分子标记和12个STS序标, 为MOD1基因的图位克隆与鉴定分析及这一区域的全序列测定奠定了基础.     

耐高温耐酸稳定假密环菌(Armillariella tabescens) MAN47β-甘露聚糖酶体外分子定向进化

从已经建立的易错PCR初级突变文库中筛选得到的16个兼具耐酸、高温稳定、高酶活力的克隆出发,将其作为DNA shuffling的亲本基因,利用DNA shuffling技术,结合易化筛选和96微孔板通量筛选的方法获得耐酸、高温稳定的克隆。并且,对筛选出来的耐酸高温稳定的突变子进行测序分析和同源建模,比较分析β-甘露聚糖酶突变基因序列的生物学信息。经过两轮DNAshuffling,最终筛选得到一个耐酸高温稳定突变体1108,其在90℃时酶活力还能维持在70%;在pH 3.0时酶活力维持在70%;在高温80℃和pH 4.0的条件下,酶活力是野生型的10倍;常规条件下(pH 6.0,40℃),酶活力是野生型酶的5倍。序列比对发现耐酸、高温稳定突变体1108有三个碱基发生了改变(T289A、A535T、T1085C),导致相应的氨基酸发生了改变(Ser97Thr、Val362Ala、Ile179Leu)。根据同源建模结果和氨基酸性质研究发现,突变位点位于催化中心附近,推测第97位的突变与酶的耐酸性和活性有关,第179位和第362位的突变与酶的高温稳定性有关。实验结果为进一步了解β-甘露聚糖酶MAN47的结构与功能之间的关系提供有用参考。     

定向进化提高嗜热拟青霉J18耐热β-1,3-1,4-葡聚糖酶在酸性条件下的催化能力

应用定向进化技术提高了嗜热拟青霉Paecilomyces thermophila J18耐热β-1,3-1,4-葡聚糖酶(PtLic16A)在酸性条件下的催化能力.结合易错PCR和DNA改组的方法,构建了β-葡聚糖酶的突变体文库;利用刚果红染色法建立了阳性克隆的高通量筛选体系.筛选得到的突变酶PtLic 16AM1的反应最适pH由7.0变化至5.5,且保持了原有的耐热性和比酶活.突变酶的DNA序列中有4个点位发生突变,引发了4处氨基酸替换,分别是T58S、Y110N、G195E和D221G.结构模拟结果显示,发生突变的4个氨基酸位点中,Y110N位置靠近酶活性中心,而T58S、G195E和D221G则离酶活性中心较远,其中T58S、G195E可能对酶最适pH的变化起到了关键作用.     

北京棒杆菌转酮酶:基因克隆、序列分析与表达

【目的】转酮酶是非氧化磷酸戊糖途径中的关键酶。从北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense PD-67)中克隆转酮酶(transketolase,EC2.2.1.1,TK)基因,并将转酮酶基因在C.pekinense PD-67中进行表达,研究增加转酮酶活性对C.pekinense PD-67生理特性的影响。【方法】分别以C.pekinense野生株AS1.299和突变株PD-67的基因组为模板,用PCR方法扩增tkt的全基因序列和前端控制序列;通过pAK6载体提高tkt基因在C.pekinense PD-67中的拷贝数,从而提高C.pekinense PD-67中转酮酶的活性。【结果】tkt基因核苷酸序列及其编码的氨基酸序列与结构分析结果表明,C.pekinense突变株PD-67与野生株AS1.299相比较,二者调控序列及结构基因核苷酸序列完全一致。与谷氨酸棒杆菌ATCC13032相比较,突变株PD-67的氨基酸序列有5个氨基酸差异,其中4个位于与辅因子硫胺素焦磷酸结合的结构域内。突变株PD-67来源的tkt基因在北京棒杆菌PD-67中得到了表达,重组菌转酮酶比活力比对照菌株提高了2倍。C.pekinense PD-67(pTK3)与对照菌株PD-67(pAK6)相比,生长加快,L-色氨酸的最终积累量也较高。【结论】本工作从C.pekinense1.299和PD-67中克隆到tkt基因,并实现tkt基因的同源表达。适当提高菌株转酮酶活力,有助于菌体生长和色氨酸积累。     

大肠杆菌AroG蛋白F209S突变体对苯丙氨酸反馈抑制作用的影响(英文)

在大肠杆菌中 ,80 %的 3 脱氧 D 阿拉伯 庚酮 7 磷酸 (3 deoxy D arabino heptulosonate 7 phosphate,DAHP)合酶由aroG基因编码。分别以大肠杆菌K1 2及其抗苯丙氨酸类似物的突变体总DNA为模板 ,以PCR方法扩增得到aroG基因及其突变体。基因测序结果表明抗苯丙氨酸类似物的突变体 ,其aroG基因核苷酸 62 5位发生了T→C的点突变 ,从而使AroG蛋白的 2 0 9位氨基酸由Ser取代了Phe。aroG基因及其突变体克隆到表达质粒 pTrc99A上 ,在大肠杆菌JM 1 0 5中进行表达 ,表达产物的SDS PAGE上可以看到分子量相当明显的条带 ;菌体粗提物中DAHP合酶的活性提高了 1 .8倍 ;酶活抗性检测表明AroG蛋白突变体在一定程度上解除了苯丙氨酸的反馈抑制作用 ;与含K1 2aroG基因的JM1 0 5细胞相比 ,含aroG基因突变体的JM1 0 5细胞可以在含高浓度苯丙氨酸类似物的培养基上生长。     

汉坦病毒K24株M和S片段基因的结构特征

为研究汉坦病毒K24株M和S片段基因的结构特征,从病毒感染细胞提取细胞总RNA,经35个循环的一次性PCR得到了与理论值相符合产物,将RT-PCR产物直接克隆T载体,经K24毒株M片段的全基因序列共3 653个核苷酸,四种核苷酸的酶切和PCR鉴定正确的克隆通过柱纯化后进行序列测定,结果比例分别为A 30.44%,T30.14%,G20.72%,C 18.70%,GC含量为39.42%,AT含量为60.58%,编码1 133个氨基酸.S片段的全基因序列共1 772个核苷酸,四种核苷酸的比例分别为A31.30%,G26.05%,T22.79%,C19.77%,GC含量为45.81%,AT含量为54.19%,共编码429个氨基酸.K24株M片段核苷酸全基因和氨基酸与HTN型毒株同源率分别为70.7%～71.2%和75.9%～76.9%,与SEO型为95.2%～99.2%和95.9%～99.4%.S片段与HTN 76～118和SEO SR-11病毒的比较,核苷酸同源率分别为74.0%和95.6%,氨基酸同源率为83.3%和97.9%,与M片段的结果相类似.M片段氨基酸与SEO型10个毒株存在4个氨基酸替代.应用DNASTAR软件的系统发生分析方法分别绘出了基于M片段核苷酸及推导氨基酸的系统发生树.     

以寡聚核苷酸为探针对癌基因Ha-ras点突变的测定

<正> 基因中一个核苷酸的改变(点突变)是原癌基因活化的途径之一。核苷酸序列分析表明,我们从胃癌细胞系中克隆出的癌基因Ha-ras,就是由于其编码区第35位核苷酸从鸟嘌呤(G)变为胸腺嘧啶(T)而被激活的。测定基因的点突变除了序列分析方法之外,还有比较简单、经济的寡聚核苷酸探针分子杂交等方法。我们按照正常的原癌基因c-Ha-ras和胃癌     

汉坦病毒K24株M和S片段基因的结构特征

为研究汉坦病毒K24株M和S片段基因的结构特征,从病毒感染细胞提取细胞总RNA,经35个循环的一次性PCR得到了与理论值相符合产物,将RT－PCR产物直接克隆T载体,要K24毒株M片段的全基因序列共3653个核苷酸,四种核苷酸的酶切和PCR鉴定正确的克隆通过柱纯化后进行序列测定,结果比较分别为A30.44%,T30.14%,G20.72%,C18.70%,GC含量为39.42%,AT含量为60.58%,编码1133个氨基酸。S片段的全基因序列共1772个核苷酸,四种核苷酸的比例分别为A31.30%,G26.05%,T22.79%,C19.77%,GC含量为45.81%,AT含量为54.19%,共编码429个氨基酸。K24株M片段核苷酸全基因和 在酸与HTN型毒株同源率分别为70.7%－71.2%和75.9%-76.9%,与SEO型为95.2%-99.2%和95.9%-99.4%。S片段与HTN76－118和SEO SR－11病毒的比较,核苷酸同源率分别为74.0%和95.6%,氨基酸同源率为83.3%和97.9%,与M片段的结果相类似。M片段氨基酸与SEO型10个毒株存在4个氨基酸替代。应用DNASTAR软件的系统发生分析方法分别绘出了基于M片段核苷酸及氨基酸的系统发生树。     

兴义鸭MEF2A基因克隆及生物信息学分析

为了获取鸭MEF2A基因完整编码区(CDS)序列,进一步揭示其遗传机理。本试验采用兴义鸭为研究对象,采用RT-PCR方法克隆获取MEF2A基因CDS区序列,经重组质粒测序、拼接,试验初步获得了兴义鸭MEF2A基因完整编码区序列,得到1 479 bp片段,包含起始密码子和终止密码子,编码492个氨基酸,表达蛋白分子量为53.14 k D。经序列对比,在G~(429)A、T~(661)A、A~(1423)G、A~(1426)G和G~(1467)A分别发生了单核苷酸突变,其中T~(661)A和A~(1423)G突变分别导致Cys(半胱氨酸)到Ser(丝氨酸)、Glu(谷氨酸)到Lys(赖氨酸)的改变,其他位点均属于同义突变。试验对兴义鸭MEF2A蛋白的理化性质及结构特点进行了简单分析,为下一步研究MEF2A蛋白特性及其作用机制奠定理论基础。