γ-谷氨酰激酶基因敲除对产L-精氨酸钝齿棒杆菌8-193 生理代谢的影响

摘要:【目的】为了阻断L-精氨酸合成的前体物L-谷氨酸的分支代谢途径,增加L-精氨酸合成的代谢流,构建钝齿棒杆菌8-193(Corynebacterium crenatum 8-193)γ-谷氨酰激酶( EC:2.7.2.11,γ-glutamyl kinase) 基因proB 敲除的菌株,并研究proB 基因敲除对菌株生理特性的影响。【方法】运用PCR 技术分别扩增proB 基因的上游和下游序列,构建带有内部缺失的proB 基因的敲除载体。经过两次同源重组,敲除C．crenatum 8-193 的pro     

抗反馈抑制的天冬氨酸激酶基因在钝齿棒杆菌中的表达

将来自钝齿棒杆菌（Corynebacterium crenatum）CD945具有AEC抗性的天冬氨酸激酶(AKfbr)基因克隆到穿梭载体pJC1上,构建重组质粒pLY153。用电击法将质粒pLY153转化到野生型菌株C. crenatum AS1.542及其突变株C. crenatum CD945中。携带AKfbr基因的C. crenatum AS1.542菌株能抗浓度皆为12mg/mL的AEC和苏氨酸。AKfbr基因在C. crenatum CD945中得到表达,天冬氨酸激酶活性提高4倍。摇瓶发酵实验结果表明,重组菌在对数前期和中期生长正常,不受抑制;与对照菌相比,赖氨酸终产量提高22％,赖氨酸生产率提高23％。     

过表达pps基因和aroG~(fbr)基因对北京棒杆菌L-色氨酸合成的影响

【目的】通过增加北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)PD-67芳香族氨基酸合成的前体物质磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的供应,解除终产物对芳香族氨基酸合成途径中第一个酶同时也是关键酶3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合酶(DS)的反馈抑制并提高抗反馈抑制的DS的活力,使碳流更多地流向芳香族氨基酸合成途径,从而积累更多L-色氨酸。【方法】运用PCR技术扩增北京棒杆菌PD-67磷酸烯醇式丙酮酸合酶基因pps,与表达载体连接构建重组质粒pXPS;运用重叠PCR技术定点突变大肠杆菌(Escherichia coli)受苯丙氨酸调控的DS基因aroG,使相应的编码氨基酸序列发生突变:Leu175Asp,新的基因命名为aroGfbr,与表达载体连接构建重组质粒pXA;构建pps和aroGfbr的共表达重组质粒pXAPS。将3个重组质粒分别转入菌株PD-67,构建工程菌株PD-67/pXPS、PD-67/pXA和PD-67/pXAPS。通过摇瓶发酵研究工程菌株的发酵特性。【结果】酶活分析结果表明,pps基因和aroGfbr基因在北京棒杆菌PD-67中均实现了表达。工程菌株PD-67/pXA粗酶液DS抗反馈抑制分析表明,AroGfbr已解除酪氨酸和苯丙氨酸的反馈抑制。过表达pps基因和aroGfbr基因分别使工程菌L-色氨酸产量提高12.1%和26.8%,双基因共表达可使工程菌的产酸量提高35.9%。【结论】北京棒杆菌PD-67pps基因的过表达以及大肠杆菌来源的解除反馈抑制的aroGfbr的过表达均有助于增加PD-67 L-色氨酸的合成,而双基因的共表达可以进一步提高L-色氨酸的积累量。     

L-精氨酸产生菌诱变育种的研究

本文报道了L-精氢酸产生菌诱变育种的研究结果。以谷氨酸产生菌钝齿棒状杆菌AS1．542为出发菌株,经亚硝基胍多次逐级诱变,获得了一株能够积累大量L-精氨酸的菌株971.1。该菌属于组氢酸缺陷型,并具有对磺胺孤的抗药性。在以葡萄糖为碳源、硫酸铵为氮源的培养基中直接发酵四天,产酸最高可达25·2 mg／ml,并具有较高的产酸稳定性。     

谷氨酸棒杆菌/大肠杆菌穿梭型启动子探测载体构建

从质粒pXZ10145和pUC19出发,构建了一个谷氨酸棒杆菌/大肠杆菌穿梭载体pAK6。pAK6的大小为5684bp,带有卡那霉素和氨苄青霉素抗性选择标记,以及多克隆位点。在pAK6基础上,构建了以氯霉素乙酰转移酶为报告基因的启动子探测载体pAKC6,pAKC6的大小为6474bp。采用鸟枪法,将经Sau3AI消化的谷氨酸棒杆菌基因组片段连入pAKC6;根据谷氨酸棒杆菌对氯霉素的抗性,从中分离出两个具有启动子功能的插入片段。通过测定报告基因氯霉素乙酰转移酶的活性,对两个启动子片段在谷氨酸棒杆菌中的强度进行了初步的判断;测序后,用启动子预测软件对其结构进行了预测,证实了启动子序列的存在。     

真养产碱杆菌112R4酰亚胺酶基因的克隆、序列分析及其在大肠杆菌中的表达

筛选到一株具海因水解活力的微生物,经鉴定后命名为真养产碱杆菌112R4。该菌能水解海因、二氢尿嘧啶和琥珀酰亚胺,且对琥珀酰亚胺活力最高,但不水解5单取代海因和5,5’双取代海因,因而被确定为含有酰亚胺酶。真养产碱杆菌112R4能在以琥珀酰亚胺为唯一碳、氮源的培养基上生长,表明该菌中存在琥珀酰亚胺完整的转化途径。从112R4基因组DNA出发,用鸟枪法克隆了一个6kb的与环酰亚胺水解相关的DNA片段;进一步亚克隆得到了带酰亚胺酶基因的2kb的DNA片段,并进行了序列测定。缺失分析确定了一个876bp的ORF为真养产碱杆菌112R4的酰亚胺酶基因,推测编码一个291个氨基酸的多肽,这是第一次报道微生物酰亚胺酶的核酸和蛋白序列。推测的氨基酸序列在蛋白数据库中进行了比较,结果表明,酰亚胺酶与已知的环酰胺酶没有明显的同源性,也不属于氨酰水解酶蛋白超家族,因而被分类为一种新的环酰胺酶。真养产碱杆菌112R4的酰亚胺酶与芽生杆菌A17p4的酰亚胺酶N端的20个氨基酸有较高的同源性,一致性为60%,与多糖脱乙酰酶保守序列也部分同源,一致性为14%。带有酰亚胺酶基因的重组质粒在大肠杆菌中得到表达,在lac启动子控制下,使用1mmol/L IPTG诱导5h,酰亚胺酶活力达到3200U/L,为供体菌真养产碱杆菌112R４的7倍。     

北京棒杆菌芳香族氨基酸转运蛋白基因敲除对L-色氨酸积累的影响

[目的]为了减少北京棒杆菌PD-67(Corynebacterium pekinense PD-67)从细胞外吸收色氨酸,降低细胞内色氨酸库的浓度,从而使色氨酸的反馈控制作用减弱,增加胞外L-色氨酸的积累量,构建北京棒杆菌PD-67的芳香族氨基酸转运蛋白基因aroP敲除的菌株,研究aroP基因敲除对菌株L-色氨酸积累的影响.并进一步研究在aroP敲除菌株中表达邻氨基苯甲酸合成酶(AS)基因对L-色氨酸积累的影响.[方法]运用PCR技术扩增aroP基因,与整合质粒连接后,用限制性内切酶法构建带有内部片段缺失的aroP基因的敲除载体.利用同源重组技术,敲除北京棒杆菌PD-67的aroP基因,构建菌株PD-67 ΔaroP,并用带有aroP基因的表达载体对PD-67ΔaroP进行互补验证.采用PCR技术扩增AS基因,与表达载体连接构建重组质粒.将重组质粒转入菌株PD-67ΔaroP,构建工程菌株PD-67 ΔaroP/pXAS.通过摇瓶发酵研究PD-67 AaroP和PD-67 ΔaroP/pXAS的发酵特性.[结果]经PCR验证获得了aroP基因缺陷的菌株.摇瓶发酵结果表明,与出发菌株相比,PD-67ΔaroP的L-色氨酸的积累量提高了65％.酶活分析结果表明,AS基因在菌株PD-67 △aroP中得到表达.AS基因表达使工程菌单位菌体产酸率提高了25.6％.[结论]北京棒杆菌PD-67中芳香族氨基酸转运蛋白基因arop的敲除能够提高胞外L-色氨酸的积累量.在arop基因敲除菌中表达AS基因,可以进一步提高工程菌的产酸率.     

发酵法生产L-精氨酸放大过程的工艺研究

本文报道了L-精氨酸产生菌株钝齿棒状杆菌突变株971．1继摇瓶发酵条件研究后所进行的2．6L台式发酵罐,2 0 0L和2000L通用发酵罐放大试验及其工艺条件研究的结果。试验表明,发酵PH值及供氧强度的合理控制对提高L-精氨酸的积累量非常重要。在所获得的工艺条件下,2000L发酵罐稳产试验的产酸率平均可达29.0mg/ml,最高32.0mg／ml。发酵液中L-精氨酸的提取收率平均为55．9％,最高可达66．04％。产品的质量符合药典标准。本文也对试验结果进行了分析与讨论。     

带有sop基因稳定表达载体的构建

F质粒的第五个EcoRⅠ片段mini-F具有质粒的分配功能。其EcoRⅠ-BamHⅠ片段含有oriS、ccd、repD和sop基因(sopA,B和C)。该片段与pBR322重组,得到质粒pDMC32。pDMC32经SmaⅠ酶切,T4连接酶连接,得到衍生质粒pDMC311,消除了oriS、ccd和repD片段。MI32(pDMC32)和MI311(pDMC311),在液体限磷基础培养基中培养100代,质粒保持率分别为93％和100％。而对照MIR322(pBR322)培养55代时,质粒保持率仅为10％。带有色氨酸启动子质粒pDR720与pBR322重组,得到质粒pDMC40。pDMC40再与mini-F的sop基因重组,得到带有sop基因的稳定表达质粒pDMC48。MI48(pDMC48)在液体限磷基础培养基中培养100代,质粒保持率为100％。