黑曲霉嗜热β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中的克隆表达及其魔芋降解产物分析

根据毕赤酵母密码子偏好性优化设计合成一段来自黑曲霉BK01的嗜热β-甘露聚糖酶基因,通过构建表达载体pPICZαA-man线性化后电转化入不同的毕赤酵母宿主,获得最佳重组菌KM71-MAN,其发酵罐发酵酶活最高达2 318.85 IU/mL。表达产物纯化后的分子量约为40 kD,最适反应温度为80℃,最适pH为5.0。该酶在70℃(pH5.0)保温44 h仍能保留43%的酶活力且在pH3.0-7.0范围内保温70 h(50℃)酶活力仍能保留85%以上。利用发酵罐所产重组酶酶解魔芋胶制备甘露低聚糖,产物以甘露二糖和甘露六糖为主,甘露低聚糖得率为55.6%。该重组β-甘露聚糖酶具有良好的热稳定性和pH稳定性,在魔芋制备甘露低聚糖中具有较好的应用潜能。     

里氏木霉内切-β-甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达

采用PCR方法从里氏木霉(Trichoderma reesei)基因组中获得含有两个内含子的内切-β-甘露聚糖酶全长基因,末端重叠延伸PCR去除内含子后,将其插入到巴斯德毕赤酵母(Picher pastoris)表达载体pPIC9K中,位于α-因子信号肽序列的下游,并与之同框,获得重组质粒pM242。重组质粒线性化后用电击法转化毕赤酵母菌株GS115。经大量筛选,获得高效分泌表达内切甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌株Gpmf25。摇瓶发酵结果表明,培养基中甘露聚糖酶的活力可达12.5IU/mL。重组酶最适pH和最适反应温度分别为5.0和80℃,在pH5.0～6.0时酶活稳定,在pH5.4时70℃保温30min酶活维持50％以上。     

一种耐热偏酸性β-甘露聚糖酶基因克隆与高效表达

【目的】克隆半纤维素降解高效菌株Bacillus subtilis BE-91的甘露聚糖酶基因并进行原核表达,对表达产物进行酶学性质研究。【方法】采用PCR扩增法从B. subtilis BE-91菌株中克隆β-甘露聚糖酶基因,分别连接到pEASY-E1和pET28a载体,导入Escherichia coli BL21(DE3)进行诱导表达。用DNS法对工程菌株的胞内和胞外β-甘露聚糖酶进行定量分析,选取胞外甘露聚糖酶活力高的组分进行酶学性质研究。【结果】从B. subtilis BE-91菌株中克隆的β-甘露聚糖酶基因(GenBank登录号：KP277209)在E. coli中获得高效表达,工程菌株pEASY-man/BL产胞外β-甘露聚糖酶的活性可达229.1 IU/mL;该基因序列全长960 bp,包含319个氨基酸的编码序列和一个终止密码子;表达产物的最适反应温度为65 °C,最适反应pH为6.0,属于耐热偏酸性β-甘露聚糖酶;该酶稳定温度≤65 °C,稳定pH为4.5?7.0;1 mmol/L的Cu2+、Mn2+、Zn2+、Ca2+对该酶有激活作用,而Ba2+和Pb2+有强烈抑制作用。【结论】B. subtilis BE-91拥有珍贵的β-甘露聚糖酶基因资源,其胞外表达产物的耐热偏酸性酶学性质在开发饲料添加剂方面具有潜在的应用前景。     

枯草杆菌manA基因的克隆及定点突变

manA是编码β-甘露聚糖酶(β-1,4-mannan mannohydrolase EC3.2.1.78)的基因。将枯草杆菌A33株的manA基因插入到pET-32a载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了异源非融合表达,表达活力为41.58U/mL。为了提高酶的表达活力,当采用PCR介导的定点突变技术将该基因第2号密码子CUU突变为GUU,构建成突变表达载体pET-32a-manA*并转入大肠杆菌BL21(DE3)中表达,目标酶表达活力增加到138.65U/mL。说明当β-甘露聚糖酶N端第二号氨基酸由亮氨酸突变为缬氨酸后,酶在大肠杆菌中的表达活力大大提高。推测是由于突变后的β-甘露聚糖酶在大肠杆菌中的稳定性增强所致。突变表达的β-甘露聚糖酶最适作用温度和pH值并没有发生明显改变。     

重组海栖热袍菌极耐热甘露聚糖酶的纯化和性质研究

研究了海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8甘露聚糖酶基因(TM_1227)的克隆、重组酶的纯化和性质.该基因全序列2010 bp,编码669个氨基酸,分子量为76.827 kD.根据氨基酸同源性分析,该β-甘露聚糖酶与Thermotoga sp.RQ2来源的β-甘露聚糖酶(GenBank登录号ACB09927.1)同源性最高,为99%.重组转化子经IPTG诱导酶比活可达39.7 U/mg蛋白.粗酶液经金属亲和层析,得到电泳纯甘露聚糖酶.以槐豆胶为底物时,该酶的最适反应温度和pH分别为95℃和pH 8.0,85℃处理30min酶活保存50%以上,很有潜力用于高温、偏碱性的造纸工业.对椰子甘露聚糖和槐豆胶的主要水解产物是不同聚合度的甘露寡糖,几乎没有单糖生成,适合生产低聚甘露糖.     

耐酸性黑曲霉β-甘露聚糖酶的克隆及其在毕赤酵母中的表达分析

目的:克隆黑曲霉β-甘露聚糖酶基因,研究该基因在毕赤酵母中的表达情况。方法:运用RT-PCR从黑曲霉AN070902中克隆β-甘露聚糖酶cDNA片段,与载体pPIC9K相连,构建重组载体VMAN-pPIC9K,电转化毕赤酵母GS115,筛选产酶最高菌株进行5 L液体发酵,对该菌株所产重组酶进行酶学性质分析。结果:克隆获得1152 bpcDNA,编码由383个氨基酸残基组成的蛋白质,该蛋白质属于GH5家族,理论pI和相对分子质量分别为4.48和41.6×103;筛选获得的重组菌株VMAN-pPIC9K-GS115在5 L液体发酵中上清酶活达11 785 U/mL;表达的重组酶是一种酸性β-甘露聚糖酶,最适反应pH值为3.0,经pH2.0～9.0处理2 h后剩余酶活保持90%以上;该重组酶最适反应温度为65℃,70℃处理1 h后剩余酶活保持75%以上;该重组酶活性被1 mmol/L的Fe3+和Mn2+显著抑制,被1mmol/L的Co2+显著激活。结论:重组耐酸性β-甘露聚糖酶的特性,决定了其在工业生产中,特别是动物饲料和食品加工中具有应用价值。     

假密环菌Armillariella tabescens EJLY2098 β-甘露聚糖酶的克隆、表达及性质分析

本研究利用RT-PCR和RACE技术从Armillariella tabescens EJLY2098(一种食用真菌)中克隆出了β-甘露聚糖酶的全长cDNA,构建到pPICZaA载体上,并在毕赤酵母GSIl5中表达了含His标签的β-甘露聚糖酶(re-atMAN47).该酶的全长cDNA共1481 bp,编码445个氨基酸,序列分析表明该序列除含有β-甘露聚糖酶结构域外,还含有CBD和GHF5的结构域,因此可被归为糖苷水解酶家族5的一个新成员.诱导培养72 h时重组酶活可达到1.067 U/mL,蛋白含量为440 mg/L.重组酶的最适反应温度为60℃.在30℃～65℃比较稳定;酶促最适pH为5.5、4.5～7.0之间比较稳定.这是首次关于Armillariella.tabescens EJLY2098产β-甘露聚糖酶的报道,得到了一个有较好热稳定性、pH稳定性和生物安全性的糖苷水解酶,将在饲料,食品、药物生产等方面有广泛的应用.     

枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中的分泌表达

目的:研制高效分泌表达枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶的毕赤酵母基因工程菌株。方法与结果:将优化设计的枯草芽孢杆菌MA139β-甘露聚糖酶基因用EcoRⅠ/XbaⅠ双酶切,克隆到诱导型表达载体pPICzαA中α因子信号肽编码序列的下游,转化大肠杆菌筛选重组质粒,转化毕赤酵母X-33感受态细胞,经Zeocin筛选,获得重组表达菌株X-33/mann。将重组菌株在10L全自动发酵罐中进行高密度发酵培养,甲醇诱导72h发酵活力达到2100U/mL。重组甘露聚糖酶的最适催化温度为40℃,最适催化pH值为6.0。结论:枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中获得了高效分泌表达,具有开发作为饲料添加剂的潜能。     

葡萄穗霉中β-甘露聚糖酶基因在黑曲霉中的表达及酶学性质

【目的】以黑曲霉(Aspergillus niger)为宿主菌来表达葡萄穗霉(Stachybotrys chartarum)中的β-甘露聚糖酶(β-mannanase)基因。【方法】通过对葡萄穗霉全基因组进行比对分析,获得编码β-甘露聚糖酶基因s16942和s331的序列信息,通过设计引物,PCR扩增得到基因s16942和s331,连接到载体pGm上,并转化到黑曲霉中,获得的转化子经过amdS二筛平板复筛,测序验证,得到高效表达此基因的工程菌株G1-pGm-s16942和G1-pGm-s331。【结果】SDS-PAGE检测结果显示,G1-pGm-s16942和G1-pGm-s331表达的蛋白分子量大小分别约为48 kDa和60 kDa,且阴性对照中没有此条带。粗酶液的酶学性质表明,G1-p Gm-s16942表达的β-甘露聚糖酶的最适反应温度为60°C,最适反应pH为7,粗酶液的酶活最高达521 U/mL;G1-p Gm-s331表达的β-甘露聚糖酶的最适反应温度为50°C,最适反应pH为7,粗酶液的酶活最高达84 U/mL。【结论】本研究首次将葡萄穗霉的β-甘露聚糖酶基因转化到黑曲霉中并成功表达,并且具有较高的活性。     

一株全基因合成耐热甘露聚糖酶的表达及酶学性质分析

根据已知耐热甘露聚糖酶ManAd3氨基酸序列与毕赤酵母密码子使用偏爱性,设计并合成了甘露聚糖酶ManA全基因(Accession No.KJ806637),与表达载体pPIC9k重组后,转化毕赤酵母GS115,筛选获得重组菌株ManA-GS115。该重组菌株发酵产物经SDS-PAGE鉴定,其中甘露聚糖酶ManA含量达到电泳纯级别,分子量大小约为30 kDa。其酶学性质检测结果显示该酶最适反应温度为75℃,最适反应pH为6.0,比活力高达3200 IU/mg,并且在75℃下处理30 min仍能维持90%以上相对酶活力。该甘露聚糖酶ManA表达量较高,在偏酸性环境下仍能够维持较高的相对酶活力,且热稳定性显著,可广泛应用于食品、酿造、饲料、纺织和医药等工业领域。     

一株全基因合成耐热甘露聚糖酶的表达及酶学性质分析

根据已知耐热甘露聚糖酶ManAd3氨基酸序列与毕赤酵母密码子使用偏爱性,设计并合成了甘露聚糖酶ManA全基因(Accession No.KJ806637),与表达载体pPIC9k重组后,转化毕赤酵母GS115,筛选获得重组菌株ManA-GS115。该重组菌株发酵产物经SDS-PAGE鉴定,其中甘露聚糖酶ManA含量达到电泳纯级别,分子量大小约为30 kDa。其酶学性质检测结果显示该酶最适反应温度为75℃,最适反应pH为6.0,比活力高达3200 IU/mg,并且在75℃下处理30 min仍能维持90%以上相对酶活力。该甘露聚糖酶ManA表达量较高,在偏酸性环境下仍能够维持较高的相对酶活力,且热稳定性显著,可广泛应用于食品、酿造、饲料、纺织和医药等工业领域。     

β-甘露聚糖酶产生菌的分离、鉴定及产β-甘露聚糖酶最适条件的研究

以采集的土壤样品为试验材料,经过富集培养及分离纯化,筛选出2株产β-甘露聚糖酶的菌株.采用摇瓶培养分别测定其酶活力,其中1株菌株酶活力较高,酶活力达50.36 U/ml.生理生化性质鉴定及16S rDNA序列相似性结果表明该菌为假单孢菌(Pseudomonas sp.).产酶的最适条件研究发现,1 g/100 ml玉米粉,2 g/100 ml魔芋粉,pH6.0,32℃为最优产酶条件,酶活力达185.37 U/ml,是优化前的3.68倍.该菌产酶迅速,培养12 h后已达产酶高峰.粗酶的性质研究发现,该酶是一种酸性的甘露聚糖酶,作用的最适pH为4.0,最适反应温度为55℃;该酶的稳定性较好,在pH4.0～6.0、温度为40～55℃保持较好的稳定性.     

Armillariella tabescens EJLY2098 β-甘露聚糖酶的克隆、表达及性质分析

本研究利用RT-PCR和RACE技术从Armillariella tabescens EJLY2098(一种食用真菌)中克隆出了β-甘露聚糖酶的全长cDNA,构建到pPICZaA载体上,并在毕赤酵母GS115中表达了含His标签的β-甘露聚糖酶(re-atMAN47)。该酶的全长cDNA共1481bp,编码445个氨基酸,序列分析表明该序列除含有β-甘露聚糖酶结构域外,还含有CBD和GHF5的结构域,因此可被归为糖苷水解酶家族5的一个新成员。诱导培养72h时重组酶活可达到1.067U/mL,蛋白含量为440mg/L。重组酶的最适反应温度为60°C,在30°C～65°C比较稳定;酶促最适pH为5.5、4.5～7.0之间比较稳定。这是首次关于Armillariella. tabescens EJLY2098产β-甘露聚糖酶的报道,得到了一个有较好热稳定性、pH稳定性和生物安全性的糖苷水解酶,将在饲料、食品、药物生产等方面有广泛的应用。     

Armillariella tabescens EJLY2098 β-甘露聚糖酶atMAN47的纯化及酶学性质分析

以魔芋精粉为唯一碳源, 对假蜜环菌(Armillariella tabescens) EJLY2098进行培养, 诱导其产生β-甘露聚糖酶。经DEAE－阴离子交换层析后, 分离纯化出β-甘露聚糖酶atMAN47。酶学性质分析: 该酶分子量约为47 kD, 酶的最适反应温度为50°C, 在pH 5.0~6.5之间该酶的稳定性较好; Na+ 和Ba2+ 对该酶有激活作用, 用TLC对酶产物分析, 表明该酶为内切β-甘露聚糖酶。该酶为偏酸性的内切甘露聚糖酶, 适合发展为饲料的酶制剂, 具有良好的应用前景。     

木聚糖酶和甘露聚糖酶在毕赤酵母中的共表达及产酶分析

木聚糖酶和甘露聚糖酶是两种重要的半纤维素酶,也是两种重要的饲用酶制剂,通过毕赤酵母表达系统中的体外串联表达盒构建多拷贝的方法构建了木聚糖酶DSB和甘露聚糖酶Man A共表达重组质粒p PICZαA/DSB-ManA,将该重组质粒电转化至宿主菌毕赤酵母X33中获得共表达两种酶的重组菌X33/DSB-ManA,实现了两种酶的共分泌表达,经诱导表达后木聚糖酶和甘露聚糖酶的酶活分别为273. 6 U/ml和256. 8 U/ml,为单独表达重组菌X33/DSB和X33/Man A酶活的30. 4%和73. 4%。酶学性质的分析显示DSB和Man A的最适反应温度均为75℃,在45℃～75℃范围内具有较好的温度稳定性,酶活可保持最高酶活的60%以上; DSB最适pH为6. 5,Man A最适pH为6. 0,在pH 3. 0、40℃条件下,Man A处理1h能保持最高酶活的80%以上,DSB处理1 h时能保持最高酶活的50%以上; DSB和Man A对多种金属离子和化学试剂(浓度为1 mM)具有较好的耐受性,均可保留60%以上的酶活力。通过单一菌株成功完成了不同酶的共表达,为复合酶饲料添加剂的生产和应用研究提供了一定的理论依据。     

β-甘露聚糖酶Man5A和木聚糖酶Tlxyn11B的融合表达

甘露聚糖酶和木聚糖酶是主要的半纤维素降解酶,在食品、饲料、纺织、造纸等工业应用广泛且通常搭配使用。文中将蓝状菌Talaromyces leycettanus JCM12802来源的性质优良的甘露聚糖酶编码基因man5A的CBM(Carbohydrate-bindingmodule)编码区去除,留下连接区和催化区,并将木聚糖酶基因Tlxyn11B成熟区编码序列与man5A的连接区进行融合,形成Tlxyn11B-linker-man5A融合基因,并在毕赤酵母中成功表达,获得了融合蛋白Tlxyn11B-Man5A。Tlxyn11B、不含CBM区的Man5A和Tlxyn11B-Man5A的理论分子量分别为21.6kDa、41.0 kDa、62.6 kDa。对纯化后的融合蛋白进行了性质分析,融合蛋白同时具有高的木聚糖酶和甘露聚糖酶活性。融合后的木聚糖酶的最适温度为70℃,较单独表达时提高了5℃。甘露聚糖酶的最适温度为90℃,与融合前一致。融合后的木聚糖酶热稳定性明显提高,60℃处理1 h剩余48%的酶活力,单独表达的木聚糖酶60℃处理20 min仅剩余20%的酶活力。融合后的木聚糖酶和甘露聚糖酶的最适pH分别为4.0和5.0,较单独表达时分别提高了0.5和1.0个单位,融合后酶的作用pH范围有所拓宽。融合前后的蛋白均具有较好的pH稳定性。融合后木聚糖酶和甘露聚糖酶的比活分别为1 784.3 U/mg和1 639.6 U/mg,较单独表达时比活(8 300 U/mg和1 979 U/mg)降低,与融合酶分子量增大相关。融合后的木聚糖酶和甘露聚糖酶的K_m值分别为1.2 mg/mL和1.7 mg/mL, V_(max)分别为2 000.0μmol/(min·mg)和2 831.6μmol/(min·mg)。综合其性质特点,融合木聚糖酶和甘露聚糖酶在饲料、食品等工业生产中有较大应用潜力,并为酶的性能改良提供了新的思路。     

木霉GXC产β-葡聚糖酶条件和酶学性质

研究了木霉GXC产β-葡聚糖酶的条件.结果表明,最适产酶碳源为麸皮,氮源为硫酸铵;产酶的最适条件为初始pH为4.0～5.0,30℃培养44h.粗酶液经硫酸铵沉淀、Sephadex G-25、Sephadex G-100和DEAE-Sehadex A-50柱层析得到纯β-葡聚糖酶,SDS-PAGE凝胶电泳显示一条带,测得分子量为35kD.该酶最适反应pH5.0,最适反应温度为60℃,在40℃以下、pH4.0～5.0酶活力相对稳定.5.0mmol/L以下的Ca2+、Zn2+和Fe2+,以及10.0mmol/L以下的Co2+对酶活力有激活作用;而Cu2+和Fe3+具有抑制作用.     

耐碱性甘露聚糖酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

通过功能平板从土壤中筛选得到含甘露聚糖酶基因的耐碱菌株。构建其基因组文库,从中筛选到甘露聚糖酶基因TM1并测序分析,用BLAST分析表明,TM1的氨基酸序列与其他在GenBank发表的甘露聚糖酶的氨基酸序列的同源性均低于60%,故确定其为一个新的甘露聚糖酶基因(GenBank登录号为AY623903)。将此基因去除信号肽后的编码序列克隆到表达载体pHBM905C上,得到重组质粒pHBM1201。经SalⅠ酶切后分别转化毕赤酵母(Pichiapastoris)KM71、GS115、SMD1168,得到分泌表达的重组毕赤酵母。挑选相对表达量最高的重组毕赤酵母SMD1168-3在摇瓶中诱导产酶,对该酶的粗酶进行酶学性质分析表明,其最适反应温度为55℃,最适PH值为7.5,以魔芋粉为底物所测得的最高酶活为41.8U,半衰期为1h,在80℃保温5min其酶活由最初酶活的77%下降到11%,温度下降到55℃后活性可恢复到最初酶活的60%以上。     

枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶补料发酵及其特性研究

采用正交实验设计对枯草芽孢杆菌产 β-甘露聚糖酶的培养基组成和培养条件进行优化 ,在此基础上进行摇瓶补料发酵 ,酶活达223.47U/mL ,较未补料的酶活提高了 32 90 %。酶反应的最适pH为 6 5 ,最适温度为 70℃ ;该酶在pH 5.0～10.0和 70℃以下稳定。水解魔芋胶产物主要为二糖以上低聚糖。     

枯草芽孢杆菌中性β-甘露聚糖酶的产生及性质

由土壤中分离出一株产中性β甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),编号BM9602。该菌在液体培养条件下,产生中性β甘露聚糖酶。多糖能作为碳源,而单糖不能作为碳源;有机氮源优于无机氮源。产酶最适培养基组成：魔芋粉4%,牛肉蛋白胨和酵母膏各1%。产酶最适培养条件：培养基起始pH85,35℃,振荡培养36〖KG*3]h。以槐豆胶为底物,培养滤液中性β甘露聚糖酶活力为96IU/mL。酶在pH50～100和50℃下稳定;作用最适条件为pH60和50℃;水解魔芋粉和槐豆胶均产生寡聚糖。