甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究

采用PCR的方法,以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis基因组 DNA 为模板,克隆出甘露聚糖酶MAN的成熟肽编码序列,将其插入巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris表达载体pPIC9K中,并位于α-因子信号肽序列的下游,获得重组质粒pPIC9K-MAN。重组质粒线性化后用聚乙二醇法导入毕赤酵母Pichia pastoris菌株GS115中,经大量筛选,获得高效分泌表达甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌株MAN22。将此菌株在5 L发酵罐中进行高密度发酵,测定酶活最高达1102IU /mL,同时对重组甘露聚糖酶的性质进行了初步研究。     

枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中的分泌表达

目的:研制高效分泌表达枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶的毕赤酵母基因工程菌株。方法与结果:将优化设计的枯草芽孢杆菌MA139β-甘露聚糖酶基因用EcoRⅠ/XbaⅠ双酶切,克隆到诱导型表达载体pPICzαA中α因子信号肽编码序列的下游,转化大肠杆菌筛选重组质粒,转化毕赤酵母X-33感受态细胞,经Zeocin筛选,获得重组表达菌株X-33/mann。将重组菌株在10L全自动发酵罐中进行高密度发酵培养,甲醇诱导72h发酵活力达到2100U/mL。重组甘露聚糖酶的最适催化温度为40℃,最适催化pH值为6.0。结论:枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中获得了高效分泌表达,具有开发作为饲料添加剂的潜能。     

里氏木霉内切-β-甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达

采用PCR方法从里氏木霉(Trichoderma reesei)基因组中获得含有两个内含子的内切-β-甘露聚糖酶全长基因,末端重叠延伸PCR去除内含子后,将其插入到巴斯德毕赤酵母(Picher pastoris)表达载体pPIC9K中,位于α-因子信号肽序列的下游,并与之同框,获得重组质粒pM242。重组质粒线性化后用电击法转化毕赤酵母菌株GS115。经大量筛选,获得高效分泌表达内切甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌株Gpmf25。摇瓶发酵结果表明,培养基中甘露聚糖酶的活力可达12.5IU/mL。重组酶最适pH和最适反应温度分别为5.0和80℃,在pH5.0～6.0时酶活稳定,在pH5.4时70℃保温30min酶活维持50％以上。     

一株全基因合成耐热甘露聚糖酶的表达及酶学性质分析

根据已知耐热甘露聚糖酶ManAd3氨基酸序列与毕赤酵母密码子使用偏爱性,设计并合成了甘露聚糖酶ManA全基因(Accession No.KJ806637),与表达载体pPIC9k重组后,转化毕赤酵母GS115,筛选获得重组菌株ManA-GS115。该重组菌株发酵产物经SDS-PAGE鉴定,其中甘露聚糖酶ManA含量达到电泳纯级别,分子量大小约为30 kDa。其酶学性质检测结果显示该酶最适反应温度为75℃,最适反应pH为6.0,比活力高达3200 IU/mg,并且在75℃下处理30 min仍能维持90%以上相对酶活力。该甘露聚糖酶ManA表达量较高,在偏酸性环境下仍能够维持较高的相对酶活力,且热稳定性显著,可广泛应用于食品、酿造、饲料、纺织和医药等工业领域。     

一株全基因合成耐热甘露聚糖酶的表达及酶学性质分析

根据已知耐热甘露聚糖酶ManAd3氨基酸序列与毕赤酵母密码子使用偏爱性,设计并合成了甘露聚糖酶ManA全基因(Accession No.KJ806637),与表达载体pPIC9k重组后,转化毕赤酵母GS115,筛选获得重组菌株ManA-GS115。该重组菌株发酵产物经SDS-PAGE鉴定,其中甘露聚糖酶ManA含量达到电泳纯级别,分子量大小约为30 kDa。其酶学性质检测结果显示该酶最适反应温度为75℃,最适反应pH为6.0,比活力高达3200 IU/mg,并且在75℃下处理30 min仍能维持90%以上相对酶活力。该甘露聚糖酶ManA表达量较高,在偏酸性环境下仍能够维持较高的相对酶活力,且热稳定性显著,可广泛应用于食品、酿造、饲料、纺织和医药等工业领域。     

硫色曲霉β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中的组成型分泌表达

目的：构建硫色曲霉β-甘露聚糖酶的毕赤酵母组成型分泌表达菌株,研究重组菌株的产酶水平。方法：EcoR I／Xba I双酶切质粒pPIC-mann-opt,琼脂糖凝胶电泳、回收目的基因片段后,与组成型毕赤酵母表达载体pGAPzαA连接,转化大肠杆菌,经筛选获得含有pGAP-mann-opt的重组克隆;提取pGAP-mann-opt,用限制性内切酶BspH I线性化后,转化毕赤酵母X-33感受态细胞,进行Zeocin抗性筛选和PCR鉴定。结果：获得了重组菌株,重组菌株在YPD培养基中摇瓶发酵24h,上清液酶活达到343U／mL,产酶蛋白约为1.0mg／mL。结论：构建的硫色曲霉β-甘露聚糖酶组成型表达菌株具有较好的应用前景。     

耐碱性甘露聚糖酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

通过功能平板从土壤中筛选得到含甘露聚糖酶基因的耐碱菌株。构建其基因组文库,从中筛选到甘露聚糖酶基因TM1并测序分析,用BLAST分析表明,TM1的氨基酸序列与其他在GenBank发表的甘露聚糖酶的氨基酸序列的同源性均低于60%,故确定其为一个新的甘露聚糖酶基因(GenBank登录号为AY623903)。将此基因去除信号肽后的编码序列克隆到表达载体pHBM905C上,得到重组质粒pHBM1201。经SalⅠ酶切后分别转化毕赤酵母(Pichiapastoris)KM71、GS115、SMD1168,得到分泌表达的重组毕赤酵母。挑选相对表达量最高的重组毕赤酵母SMD1168-3在摇瓶中诱导产酶,对该酶的粗酶进行酶学性质分析表明,其最适反应温度为55℃,最适PH值为7.5,以魔芋粉为底物所测得的最高酶活为41.8U,半衰期为1h,在80℃保温5min其酶活由最初酶活的77%下降到11%,温度下降到55℃后活性可恢复到最初酶活的60%以上。     

共表达透明颤菌血红蛋白对毕赤酵母产β-甘露聚糖酶发酵过程的影响

为了改善高密度发酵生产β-甘露聚糖酶过程中的溶氧限制,提高β-甘露聚糖酶产量,将VHb和β-甘露聚糖酶基因置于AOX1启动子调控之下,进行VHb和β-甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的共表达。经密码子优化合成VHb基因,插入表达载体p PICZαA,整合到β-甘露聚糖酶工程菌中,通过G418和Zeocin抗性筛选共表达VHb基因的重组酵母工程菌。在30 L发酵罐水平上分析共表达VHb菌株(VHb+)与初始菌株(VHb-)对β-甘露聚糖酶表达的差异。结果显示,限氧条件下,VHb+菌株的β-甘露聚糖酶的表达量比对照菌株VH b-高90%,且透明颤菌血红蛋白提高了甲醇耐受性,缩短发酵周期约40 h。     

黑曲霉嗜热β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中的克隆表达及其魔芋降解产物分析

根据毕赤酵母密码子偏好性优化设计合成一段来自黑曲霉BK01的嗜热β-甘露聚糖酶基因,通过构建表达载体pPICZαA-man线性化后电转化入不同的毕赤酵母宿主,获得最佳重组菌KM71-MAN,其发酵罐发酵酶活最高达2 318.85 IU/mL。表达产物纯化后的分子量约为40 kD,最适反应温度为80℃,最适pH为5.0。该酶在70℃(pH5.0)保温44 h仍能保留43%的酶活力且在pH3.0-7.0范围内保温70 h(50℃)酶活力仍能保留85%以上。利用发酵罐所产重组酶酶解魔芋胶制备甘露低聚糖,产物以甘露二糖和甘露六糖为主,甘露低聚糖得率为55.6%。该重组β-甘露聚糖酶具有良好的热稳定性和pH稳定性,在魔芋制备甘露低聚糖中具有较好的应用潜能。     

Armillariella tabescens EJLY2098 β-甘露聚糖酶的克隆、表达及性质分析

本研究利用RT-PCR和RACE技术从Armillariella tabescens EJLY2098(一种食用真菌)中克隆出了β-甘露聚糖酶的全长cDNA,构建到pPICZaA载体上,并在毕赤酵母GS115中表达了含His标签的β-甘露聚糖酶(re-atMAN47)。该酶的全长cDNA共1481bp,编码445个氨基酸,序列分析表明该序列除含有β-甘露聚糖酶结构域外,还含有CBD和GHF5的结构域,因此可被归为糖苷水解酶家族5的一个新成员。诱导培养72h时重组酶活可达到1.067U/mL,蛋白含量为440mg/L。重组酶的最适反应温度为60°C,在30°C～65°C比较稳定;酶促最适pH为5.5、4.5～7.0之间比较稳定。这是首次关于Armillariella. tabescens EJLY2098产β-甘露聚糖酶的报道,得到了一个有较好热稳定性、pH稳定性和生物安全性的糖苷水解酶,将在饲料、食品、药物生产等方面有广泛的应用。     

两拷贝β-甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达

目的:旨在获得高效分泌表达的两拷贝β-甘露聚糖酶(β-mannase)毕赤酵母工程菌株。方法:以作者研究室保藏的黑曲霉β-mannase X33菌株(X33-β-mannase)为出发菌株,体外构建两拷贝重组质粒pPIC-mannase,用电击法转化至X33感受态细胞,用抗生素Zeocin筛选阳性转化子,用BMGY培养基培养,BMMY诱导其表达,利用DNS法测定酶活。结果:实验已成功构建了两拷贝β-mannase毕赤酵母工程菌株,50 L发酵罐培养7 d后,β-mannase产酶水平达到21 300 U/ml。     

黑曲霉阿魏酸酯酶在毕赤酵母中的组成型表达

【目的】实现黑曲霉来源的阿魏酸酯酶在毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)中的组成型表达。【方法】以黑曲霉(Aspergillus niger)基因组为模板,经重叠延伸PCR扩增得到阿魏酸酯酶基因(AnfaeA),将其与载体pGAP9K相连,构建重组表达载体p GAP9KAnfae A,经SalI线性化后电转入毕赤酵母GS115中,得到重组菌株。高效液相色谱法测定发酵液中阿魏酸酯酶活力,并对重组菌进行了发酵优化。【结果】克隆得到783 bp的阿魏酸酯酶编码基因并实现了其在毕赤酵母中的组成型表达。重组菌发酵84 h后,上清液中酶活达5.72±0.10 U/m L。重组酶(reAnfaeA)经分离纯化后比酶活为59.75 U/mg,大小约为40 k D。发酵优化结果为:葡萄糖40.0 g/L,蛋白胨10.0 g/L,酵母膏30.0 g/L,CaCO_3 0.2 g/L,种龄28 h,接种量3%(体积比),装液量50 m L/250 m L。在此条件下发酵培养,酶活达15.60±0.23 U/m L。【结论】阿魏酸酯酶在毕赤酵母中的组成型表达,对研究毕赤酵母组成型表达系统和阿魏酸酯酶的发酵生产具有一定的借鉴意义。     

一种耐热偏酸性β-甘露聚糖酶基因克隆与高效表达

【目的】克隆半纤维素降解高效菌株Bacillus subtilis BE-91的甘露聚糖酶基因并进行原核表达,对表达产物进行酶学性质研究。【方法】采用PCR扩增法从B. subtilis BE-91菌株中克隆β-甘露聚糖酶基因,分别连接到pEASY-E1和pET28a载体,导入Escherichia coli BL21(DE3)进行诱导表达。用DNS法对工程菌株的胞内和胞外β-甘露聚糖酶进行定量分析,选取胞外甘露聚糖酶活力高的组分进行酶学性质研究。【结果】从B. subtilis BE-91菌株中克隆的β-甘露聚糖酶基因(GenBank登录号：KP277209)在E. coli中获得高效表达,工程菌株pEASY-man/BL产胞外β-甘露聚糖酶的活性可达229.1 IU/mL;该基因序列全长960 bp,包含319个氨基酸的编码序列和一个终止密码子;表达产物的最适反应温度为65 °C,最适反应pH为6.0,属于耐热偏酸性β-甘露聚糖酶;该酶稳定温度≤65 °C,稳定pH为4.5?7.0;1 mmol/L的Cu2+、Mn2+、Zn2+、Ca2+对该酶有激活作用,而Ba2+和Pb2+有强烈抑制作用。【结论】B. subtilis BE-91拥有珍贵的β-甘露聚糖酶基因资源,其胞外表达产物的耐热偏酸性酶学性质在开发饲料添加剂方面具有潜在的应用前景。     

纤维二糖差向异构酶在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究

首先将来源于Caldicellulosiruptor saccharolyticus的纤维二糖差向异构酶基因CsCEm进行密码子优化,然后进行全基因合成,再将其引入到载体pPIC9K中,构建重组质粒pPIC9K-CsCEm并转化入毕赤酵母GS115,得到酵母工程菌株.经微孔板筛选、摇瓶筛选得到酶活最高的重组工程茵GS115-4-19.该菌株经甲醇诱导144 h后,摇瓶发酵液上清酶活达到0.42 U/mL.酶学性质研究结果表明:该酶的最适pH为7.5,且在pH 6.0 ～8.0范围内相对酶活都在80％以上;在pH 4～9的缓冲液中放置24 h后仍保持原酶活力的80％以上;最适温度为80℃,在60℃～80℃保温30 min后,相对酶活在80％以上.动力学研究结果表明该酶对底物乳糖的Km和Vmax分别为(120.27±9.96) mmol/L和(1.035±0.05) mmol/L/min.纤维二糖差向异构酶在毕赤酵母中的成功表达为生物酶法合成乳果糖提供了重要参考.     

假密环菌Armillariella tabescens EJLY2098 β-甘露聚糖酶的克隆、表达及性质分析

本研究利用RT-PCR和RACE技术从Armillariella tabescens EJLY2098(一种食用真菌)中克隆出了β-甘露聚糖酶的全长cDNA,构建到pPICZaA载体上,并在毕赤酵母GSIl5中表达了含His标签的β-甘露聚糖酶(re-atMAN47).该酶的全长cDNA共1481 bp,编码445个氨基酸,序列分析表明该序列除含有β-甘露聚糖酶结构域外,还含有CBD和GHF5的结构域,因此可被归为糖苷水解酶家族5的一个新成员.诱导培养72 h时重组酶活可达到1.067 U/mL,蛋白含量为440 mg/L.重组酶的最适反应温度为60℃.在30℃～65℃比较稳定;酶促最适pH为5.5、4.5～7.0之间比较稳定.这是首次关于Armillariella.tabescens EJLY2098产β-甘露聚糖酶的报道,得到了一个有较好热稳定性、pH稳定性和生物安全性的糖苷水解酶,将在饲料,食品、药物生产等方面有广泛的应用.     

黑曲霉纤维二糖水解酶基因cbhA在毕赤酵母中异源表达

[目的]对黑曲霉纤维二糖水解酶cbhA基因进行了克隆和在毕赤酵母中的真核表达。[方法]采用PCR方法扩增黑曲霉纤维二糖水解酶A(Cellobiohydrolase A,CBHA)基因,获得的DNA序列与cbhA基因表现出高度相似,推导出的氨基酸序列与真菌CBHA酶也高度相似,属于糖基水解酶第7家族。将扩增得到的cbhA基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K上,与α-因子信号肽序列形成融合蛋白,进一步通过电转化方法将线性化质粒p PIC9K-cbhA转化至毕赤酵母GS115菌株进行表达。[结果]在甲醇诱导下,重组菌株CMC比酶活力是对照的2.5倍,SDS-PAGE分析结果也确认了cbhA基因在重组菌株GS115/p PIC9K-cbhA中的表达。对该酶性质的分析表明,重组CBHA酶水解CMC底物最适p H值为5.0,最适温度为55℃。[结论]黑曲霉纤维二糖水解酶基因cbhA的克隆和其真核表达工程菌株的构建,为获得纤维二糖水解酶A高产菌株,实现纤维素酶多组分的人工组装奠定了基础。     

扣囊复膜孢酵母β-葡萄糖苷酶基因在毕赤酵母中的克隆与表达

利用PCR技术,从扣囊复膜孢酵母的总DNA中扩增得到β-葡萄糖苷酶（β-Glucosidase）基因（BGL1）,长度为2596 bp,连接到pGEM-T载体上,用限制性内切酶切下目的基因,插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K中,使之位于α-因子信号肽下游,且与之同框,构建成重组质粒pSHL9K.通过电转化将重组质粒pSHL9K插入到Pichia pastoris GS115菌株染色体中,获得高效表达BGL1基因的毕赤酵母重组工程菌株.重组酶的最适温度为50℃,最适pH为5.4.培养基中β-葡萄糖苷酶活性最高可达47U/mL.     

RT-PCR检测毕赤酵母外源β-甘露聚糖酶基因拷贝数

利用荧光定量PCR方法检测毕赤酵母外源β-甘露聚糖酶基因(man)拷贝数。以毕赤酵母中高度保守基因三磷酸甘油醛脱氢酶基因(gap)为内参基因,分别构建含有gap和man的克隆质粒,进行RT-PCR反应构建gap和man双标准曲线;获得的双标准曲线具有良好的重复性,其相关系数(R2)均为0.999,其扩增效率分别为105.1%和102.2%。提取含有外源man基因的毕赤酵母基因组进行RT-PCR检测,通过双标准曲线计算出外源man基因的拷贝数。结果显示:预先经过博莱霉素(Zeoicn)抗性筛选得到的10株毕赤酵母重组菌株中含有1、2、3、4、5和7个不等拷贝的β-甘露聚糖酶基因。结果表明该方法能够高效快速筛选和鉴定出含有不同外源β-甘露聚糖酶基因拷贝数的毕赤酵母重组菌株。     

产β-甘露聚糖酶菌株的筛选鉴定及产酶条件的优化

利用刚果红染色法从土壤中筛选到一株产β-甘露聚糖酶的菌株MY271,该菌株经形态学、生理生化及系统发育学方法鉴定为路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigii)。该菌株在初始条件下培养48 h,发酵上清液中β-甘露聚糖酶酶活可达2.87 U/m L。利用单因素试验对该菌产酶发酵条件进行优化以提高酶活,优化所得最佳发酵条件为:接种量9%,装液量50 m L/250 m L,初始p H7.0,发酵温度31℃,发酵周期48 h。最佳碳源为魔芋精粉(添加量0.8%),最佳氮源为蛋白胨(添加量1.9%)。在最佳条件下发酵48 h,发酵上清液中β-甘露聚糖酶活提升到38.42 U/m L,是优化前的13.4倍。     

扣囊复膜孢酵母β-葡萄糖苷酶基因在毕赤酵母中的克隆与表达

利用PCR技术,从扣囊复膜孢酵母的总DNA中扩增得到β-葡萄糖苷酶（β-Glucosidase）基因 (BGL1),长度为2596 bp,连接到pGEMT载体上,用限制性内切酶切下目的基因,插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K中,使之位于α-因子信号肽下游,且与之同框, 构建成重组质粒pSHL9K。 通过电转化将重组质粒pSHL9K插入到Pichia pastoris GS115菌株染色体中,获得高效表达BGL1基因的毕赤酵母重组工程菌株。重组酶的最适温度为50℃,最适pH为5.4。培养基中β-葡萄糖苷酶活性最高可达47U/mL。