一株产耐高温β-甘露聚糖酶菌株的筛选鉴定

目的:筛选鉴定一株产耐高温β-甘露聚糖酶的天然菌株。方法:通过形态、生理生化特征及16S rDNA比对,对从水温高于68℃的热泉中分离出的一株产β-甘露聚糖酶细菌进行鉴定。结果:该菌株的最适生长温度为50℃,可在35～80℃条件下生长,确定为一种极端嗜热枯草芽胞杆菌;该菌所产的β-甘露聚糖酶可耐受90℃高温处理。结论:产耐高温β-甘露聚糖酶极端嗜热枯草芽胞杆菌的筛选鉴定,为后续重组耐高温β-甘露聚糖酶的开发奠定了基础。     

N-糖基化对一种新型重组耐高温β-甘露聚糖酶(ReTMan26)稳定性的影响

【背景】对来源于嗜热枯草芽孢杆菌(TBS2)的一种新型重组耐高温β-甘露聚糖酶(ReTMan26)基因序列进行分析,该基因中含有3个N-糖基化位点(N8、N26与N255),经毕赤酵母表达时可进行N-糖基化修饰。【目的】确定N-糖基化对ReTMan26稳定性的影响。【方法】通过构建ReTMan26蛋白质三维结构模型,初步分析N-糖基化对该酶稳定性的影响。在此基础上,利用天然蛋白去糖基化试剂盒除去ReTMan26的N-多糖链,获得去除N-糖基化的耐高温β-甘露聚糖酶(ReTMan26-DG),并对纯化后的ReTMan26及ReTMan26-DG进行相应的稳定性对比检测。【结果】ReTMan26与ReTMan26-DG的最适反应pH均为6.0,但在pH1.5-9.0范围内,ReTMan26的稳定性比ReTMan26-DG有小幅提高。ReTMan26的最适反应温度为60°C,比ReTMan26-DG高5°C;ReTMan26经100°C处理10 min,剩余酶活为58.6%,而ReTMan26-DG经93°C处理10 min,剩余酶活为58.2%,100°C处理10min则完全失活。经胃蛋白酶及胰蛋白酶在37°C处理2h后,ReTMan26的剩余酶活分别为70.5%及91.2%,比ReTMan26-DG分别提高了23.7%及25.6%。【结论】N-糖基化可提高ReTMan26的pH稳定性、耐热稳定性及抗蛋白酶消化性能。     

耐酸性黑曲霉β-甘露聚糖酶的克隆及其在毕赤酵母中的表达分析

目的:克隆黑曲霉β-甘露聚糖酶基因,研究该基因在毕赤酵母中的表达情况。方法:运用RT-PCR从黑曲霉AN070902中克隆β-甘露聚糖酶cDNA片段,与载体pPIC9K相连,构建重组载体VMAN-pPIC9K,电转化毕赤酵母GS115,筛选产酶最高菌株进行5 L液体发酵,对该菌株所产重组酶进行酶学性质分析。结果:克隆获得1152 bpcDNA,编码由383个氨基酸残基组成的蛋白质,该蛋白质属于GH5家族,理论pI和相对分子质量分别为4.48和41.6×103;筛选获得的重组菌株VMAN-pPIC9K-GS115在5 L液体发酵中上清酶活达11 785 U/mL;表达的重组酶是一种酸性β-甘露聚糖酶,最适反应pH值为3.0,经pH2.0～9.0处理2 h后剩余酶活保持90%以上;该重组酶最适反应温度为65℃,70℃处理1 h后剩余酶活保持75%以上;该重组酶活性被1 mmol/L的Fe3+和Mn2+显著抑制,被1mmol/L的Co2+显著激活。结论:重组耐酸性β-甘露聚糖酶的特性,决定了其在工业生产中,特别是动物饲料和食品加工中具有应用价值。