用两步MS-PCR结合ELISA检测HIV-1逆转录酶基因的耐药性突变

高效抗逆转录病毒治疗法（HAART）的推广使用有效地抑制了HIV-1病毒的传播和艾滋病（AIDS）的发病率、死亡率。近年来,HIV-1逆转录酶基因突变所导致的耐药性成为了HAART的治疗失败的主要原因,耐药性突变的检测对于指导病人用药以及新药开发具有重要意义。本工作发展了一种检测HIV-1逆转录酶基因耐药性突变的新方法。采用两步MS-PCR方法检测HIV-1 B亚型野生型和耐药突变型逆转录酶基因突变,检测点包括M41L、K70R、K103N、Y181C和T215,并在两步MS-PCR基础上,设计比野生型引物长的突变型引物,结合微孔板杂交ELISA呈色技术检测各点突变。结果显示,简化的两步MS-PCR能保持灵敏度和特异性高的优点,ELISA的阳性结果与阴性结果的比值（P/N）达到要求,两步MS-PCR结合ELISA方法灵敏度高,操作简单、结果直观、成本低、相对耗时短且能进行高通量检测,其无论在HIV-1耐药性突变及其它的点突变检测中具有较好的临床应用前景。     

小鼠GM-CSF的基因克隆和锚定修饰

将糖基化磷脂酰肌醇(GPI）锚定修饰的细胞因子直接转移到肿瘤细胞膜上,是研究治疗性肿瘤疫苗的一种有潜力的新策略。克隆了小鼠GM-CSF基因,井通过将从衰变加速因子（DAF）来源的GPI修饰性信号序列与mGM—CSF、嵌合,获得了GPI修饰的mGM-CSF分子,构建并鉴定了GPI锚定修饰的真核表达裁体pCI／GPI-mGM-CSF,为进一步研究表面工程治疗性肿瘤疫苗奠定了基础。     

激光联合环磷酰胺对荷瘤鼠脾重和外周免疫细胞数量影响的试验研究

目的:试验以小鼠S180腹水瘤为动物实验模型,对He-Ne激光照射与化疗药物联合应用对S180荷瘤鼠脾脏重量和免疫细胞数量影响作了系统性研究。方法:应用11.00J/cm2,14.67J/cm2和22.00J/cm2三种剂量He-Ne激光照射荷瘤鼠内眼角,同时联合应用化疗药物环磷酰胺,以观察其对荷瘤鼠脾脏重量和免疫细胞数量的影响。结果:健康小鼠脾脏随日龄增加呈持续上升趋势,肿瘤对照组及CYT对照组在第4d.显著升高。此后便持续下降,尤其是CYT对照组,第8d.荷瘤鼠脾脏萎缩极为严重。而CYT/He-Ne激光联合应用组小鼠脾脏在第4d.轻微下降后,便呈持续上升趋势;CYT对外周血白细胞总数、淋巴细胞数和中性幼稚细胞数有着显著的抑制作用(P<0.01,P<0.05)。CYT/He-Ne激光联合应用组白细胞总数和中性幼稚细胞数的变化较单纯CYT应用组为轻微。结论:He-Ne激光对CYT及肿瘤本身所致免疫抑制具有明显的改善效应。     

低能量激光照射对小鼠脾脏NK细胞活性影响的试验研究

目的：研究能量激光照射对小鼠NK细胞活性的影响,以便从NK细胞活性的角度阐明其免疫调节效应。方法：以BALB／c小鼠为研究对象,应用7.337J/cm^2,11．00J/cm^2,14．67J/cm^2,22．00J/cm^2和36．67J/cm^2五种剂量的氦氖激光作小鼠内眼角照射,连续照射8d,并于照射开始后第3d,6d,9d,13d和第17d,动脉监测实验鼠脾脏NK细胞活性。结果：以日剂量为7.33J/cm^2,11.00J/cm^2,14.67J/cm^2和22.00J/cm^2LELI照射小鼠四个剂量组均可增强NL细胞的活性（P＜0．01或P＜0．05）,但其峰值的出现随着LELI剂量的增大而加快,22．00J/cm^2剂量组在第3d就达到峰值,而其余三组则分别在第9d或第13d时达到峰值,与相相反,大剂量36.6J/cm^2ELEI组NK活性则表现出明显的抑制效应。结论：适当剂量的低能量激光照射剂可对小鼠脾脏NK细胞活性产生增强效应,而过大剂是LELI则产生抑制效应。     

磁珠分离DNA技术检测HIV-1逆转录酶基因耐药性突变

HIV-1逆转录酶基因突变导致的耐药性严重影响了药物对病人的治疗效果,耐药性突变的检测对于指导合理用药具有重要意义。本工作发展了一种检测HIV-1逆转录酶基因耐药性突变的新方法。在两步MS-PCR方法的基础上,引入磁珠分离DNA技术并结合酶联免疫吸附检测方法(ELISA)检测逆转录酶基因耐药性突变T215F和Y181C。结果显示： MS-PCR结合磁珠分离技术和ELISA具有较高的灵敏度和特异性,阳性/阴性比值（P/N值）达到要求,突变型模板检测限为5%左右,耗时短且能进行高通量检测。无论在HIV-1耐药性突变还是其它的点突变检测中,该方法都具有较好的临床应用前景。     

超抗原SEA的GPI锚定修饰和在CHO-dhfr~-细胞膜上的表达

将GPI锚定修饰的免疫分子直接转移到肿瘤细胞膜上,是研究治疗性肿瘤疫苗的一种有潜力的新策略。通过将从衰变加速因子(DAF)来源的GPI修饰性信号序列与SEA嵌合,获得了GPI修饰的SEA分子,构建的真核表达载体pCIGPI-SEA,用脂质体方法转染到CHOdhfr-细胞中,并用氨甲喋呤(MTX)进行筛选,细胞免疫荧光分析证实,SEA能够在细胞膜上表达。上述GPI锚定修饰的SEA,可用于进一步研究治疗性肿瘤疫苗。     

CTLA4Ig融合蛋白在CHO细胞中的表达

CTLA4Ig是人CTLA4胞外区与人免疫球蛋白铰链区、CH2区、CH3区组成的融合蛋白,可以与B7结合,通过阻断B7与CD28的结合,从而阻断B7介导的T细胞活化必需的共刺激信号,可作为免疫抑制剂用于器官移植。将CTLA4Ig融合分子克隆到真核表达载体pCI-dhfr,并用脂质体方法转染到COS7和CHO-dhfr-细胞中,用氨甲喋呤筛选转染的CHO-dhfr-细胞。用RT-PCR、ELISA、细胞免疫荧光染色和Western-blot鉴定重组蛋白的表达。采用A蛋白纯化重组蛋白。     

焦磷酸测序技术在确认北京严重急性呼吸综合征(SARS)病毒株并检测基因突变中的应用

结合严重急性呼吸综合征(SARS)病毒株序列信息分析和高通量测序技术,建立一种快速、简单地确定SARS病毒株并筛查SARS病毒突变位点和突变频率的方法。从感染人SARS病毒的Vero-6细胞中提取病毒RNA,反转录为cDNA后,PCR扩增目的基因片段,采用焦磷酸测序技术(Pyrosequencing Technology,PSQ)进行第2601、7919、9479、19838多个碱基突变位点测序和突变频率分析。通过测序分析多个可能出现突变的位点,确定了该病毒为北京流行株,同时发现第7919位碱基发生了A／G突变。PSQ技术对于高通量筛选研究病毒基因的突变和确定病毒株型别有着简单、快速、灵敏的特点。利用生物信息学分析核酸多态性,结合实验验证,可以确定SARS病毒流行株的特征,有利于对突发事件及早确定传染来源。     

HIV-1整合酶蛋白的可溶性表达及功能研究

HIV 1整合酶是HIV病毒复制中一个重要的酶,也是治疗艾滋病药物的一个重要靶点。为了开展以整合酶蛋白为靶点的抑制剂筛选,构建HIV 1整合酶重组质粒,在原核细胞中进行可溶性表达和功能研究。通过重叠PCR技术引入F185K和C280S突变于HIV 1 B亚型标准株的整合酶cDNA片段中,PCR扩增片段克隆到pET 28a(+)表达载体中,构建重组质粒,在E. coli中进行整合酶基因表达,SDS PAGE鉴定表达产物,亲和层析纯化蛋白,酶联免疫吸附实验方法测定整合酶的生物学活性。结果构建的重组质粒获得高效稳定的可溶性表达,ELISA实验证实该蛋白具有整合酶的3′切割DNA和5′链转移的活性。HIV 1整合酶蛋白的可溶性表达和活性研究为建立以整合酶为靶点的抗HIV药物筛选平台打下了基础。     

低能量氦氖激光照射对荷瘤小鼠T淋巴细胞增殖反应的影响

目的：本文研究低能量氦氖激光照射荷瘤小鼠,观察对荷瘤Ｔ淋巴细胞增殖反应的影响。结果：ＢＡＬＢ／Ｃ雄性小鼠腹腔接种Ｓ１８０接种后,进行激光照射小鼠内眼角,测定正常对照组、肿瘤对照组和７．３３、１１．００、１４．６７、２２．００Ｊ／ｃｍ＾２和２９．３３Ｊ／ｃｍ＾２五个剂量激光照射组小鼠的Ｔ淋巴细胞增殖反应,结果表明１１．００Ｊ／ｃｍ＾２、１４．６７Ｊ／ｃｍ＾２、２２．００Ｊ／ｃｍ＾２剂量的氦氖激光照射