法尼醇X受体激动剂细胞筛选体系的建立与优化

本研究旨在建立一种基于双荧光素酶报告基因检测体系的法尼醇X受体(farnesoid X receptor, FXR)激动剂细胞筛选体系,以满足对FXR激动剂先导化合物的高通量筛选。通过在报告基因质粒pGL4-luc2P-Hygro中的萤火虫荧光素酶(firefly luciferase,Luc)基因上游克隆并插入来自FXR靶基因的FXR反应元件(FXR response element,FXRE)片段,构建用于筛选FXR激动剂的报告基因质粒,并结合海肾荧光素酶内参质粒,建立能够有效反映药物对FXR激动效应的双荧光素酶报告基因细胞检测体系。通过一系列优化实验,比较了过表达RXR、鼠源和人源FXR、不同的FXRE片段、FXR过表达质粒与报告基因质粒的混合比对筛选体系诱导效率和灵敏度的影响。根据上述结果,最终确定了优化条件,优化后体系Z因子达到0.83。本研究建立了一种用于FXR激动剂筛选的改良的基于双荧光素酶报告基因检测体系的细胞筛选体系,其主要特征在于,使用多段FXR靶基因上的FXRE片段叠加组成一种新型的增强型FXRE元件,而非传统的反向重复序列-1 (inverted repeats...     

一种基于lacZ基因和pUC复制子的原核启动子报告系统的构建及评价

为构建一种具有广泛适用性的原核启动子报告系统,以质粒pFLX107为骨架,通过多克隆位点替换和序列改造,构建出基于lacZ基因和pUC复制子的pFGH系列报告载体,然后以lacZ基因缺失株MC4100为宿主菌筛选背景活性最低的质粒作为最终的报告系统,并利用诱导型启动子araBAD和组成型启动子rpsM分别对其进行测试。结果显示,在所构建的pFGH系列质粒中,pFGH06的背景活性显著低于同系列其他质粒,在28 ℃培养条件下甚至显著低于低拷贝参考质粒pRCL的活性 (P<0.01)。进一步的评估测试显示,质粒pFGH06可用于诱导型启动子或组成型启动子的克隆及活性测定,且在模拟应用于启动子筛选时,通过蓝白斑筛选即可实现对目标启动子的完全识别。与已报道的原核启动子报告系统相比,pFGH06具有体积小、克隆位点多、背景活性可调、对启动子筛选识别效率高等优点,具有广泛的应用前景。     

Gaussia分泌型萤光素酶的研究进展及其应用

Gaussia分泌型萤光素酶是近年发现的一种来源于海洋桡脚类动物Gaussia princeps的新型分泌型萤光素酶,是目前已知的可自然分泌的最小萤光素酶,因其分子小、灵敏度高、半衰期短和可高效分泌,而成为一种理想的报告基因,广泛应用于体内外研究。我们就Gaussia分泌型萤光素酶的发光原理、荧光特性及其应用等进行简要综述。     

人p53启动子萤光素酶报告基因的构建及其活性测定

目的：克隆p53基因的启动子,插入萤光素酶报告基因载体,并检测启动子活性。方法：采用PCR技术从人肝癌细胞系HepG2基因组中扩增人p53启动子,插入萤光素酶报告基因载体pGL4．0-empty,将重组质粒转染293T、ZR75-1、HepG2、A549细胞,测定p53启动子的转录活性。结果：构建了p53启动子的萤光素酶报告基因;通过测序及质粒酶切鉴定,所构建的p53启动子正确;活性实验表明,报告基因在多种细胞中显示构建的p53启动子活性,并呈现一定的剂量效应;转录因子USF能以剂量效应方式提高p53报告基因的转录活性。结论：克隆了人p53启动子,为进一步研究调控p53的转录因子奠定了基础。     

人apoA-Ⅰ基因启动子转录上调剂筛选系统的建立与应用

PCR扩增含有apoA-Ⅰ基因的转录调控序列的启动子片断（376 bp）,克隆入含有荧光素酶报告基因和新霉素抗性基因的pGL3B-neo载体中,构成受apoA-Ⅰ启动子调控的重组报告基因质粒pGL3B-neo：：apo,稳定转染人肝癌细胞株HepG2。通过细胞有限稀释法筛选稳定表达荧光素酶活性的细胞株SAPOA-Ⅰ。经apoA-Ⅰ转录调控因子PPARα激动剂的鉴定和细胞接种密度、溶剂使用浓度等条件的优化,成功建立了靶向apoA-Ⅰ基因启动子转录活性的报告基因筛选体系。应用该体系对400多种降脂中药提取物进行筛选,泽泻、罗布麻叶、山楂等提取物显示出较好的上调活性,与文献报道采用动物模型研究的结果一致。     

转基因海带的研究现状

海带是海洋中一种极其重要的经济海藻。转基因技术在海带科研中的应用,将使海带的附加值得到进一步的提高。就海带遗传转化方法,以及转GUS基因、转lacZ基因、转CAT基因、转bar基因等报告基因和转HBsAg基因、转r-PA基因等功能基因海带的研究现状进行了综述。     

NF-κB决定小鼠胎肝激酶-1基因启动子的基本活性

为克隆小鼠胎肝激酶-1（fetal liver kinase-1,FLK-1）基因上游启动子序列,并观察其不同截短片段在小鼠血管内皮细胞中的启动子活性,以小鼠全基因组为模板,通过PCR扩增方法获得-258～+299 bp、-96～+299 bp、-71～+299 bp、-36～+299 bp大小的FLK-1启动子片段,将其定向克隆入pGL3 Basic,构建荧光素酶报告基因载体,并制备NF -κB结合位点的突变或缺失体.在阳离子脂质体介导下,报告基因载体瞬时转染小鼠血管内皮细胞株SVEC 4-10.结果发现,在小鼠血管内皮细胞中,各FLK-1启动子片段均有活性;－71～－36 bp区存在FLK-1启动子的核心调控元件.针对该区域NF-κB结合位点进行突变或缺失,能导致启动子活性显著降低;凝胶电泳迁移率实验表明该区段能结合转录因子NF-κB.结果提示,成功克隆了在血管内皮细胞中具有活性的FLK-1上游启动子序列,NF-κB是决定其基本活性的重要转录因子,为进一步研究FLK-1基因的转录调控机制奠定了基础.     

抗性基因报告系统辅助选育厦门霉素A高产菌株

【背景】厦门霉素A是厦门链霉菌(Streptomyces xiamenensis) 318菌株的主要次级代谢产物,具有显著的抗纤维化活性及药用潜力。但野生型菌株中厦门霉素A的产量仅有14 mg/L,其生产水平亟待提升。【目的】通过随机诱变-抗性标记筛选获得高产菌株并进行培养基优化,以提高厦门霉素A的产量。【方法】在厦门霉素A的生物合成基因簇后融合一个抗性基因,用于报告整个基因簇的表达水平。对构建的基因工程菌株进行常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)诱变,从抗性水平高的突变菌株中筛选高产菌株,并通过培养基优化,使厦门霉素A产量显著提升。【结果】构建携带卡那霉素抗性标记的产厦门霉素A的工程菌MT-XN作为出发菌株,对该菌株进行一轮ARTP诱变,使用90 mg/L卡那霉素筛选,得到了厦门霉素A产量为101.7 mg/L的突变菌株MA-8。进一步通过响应面法优化培养基配方,在最佳培养基中MA-8菌株产生的厦门霉素A达到134.2 mg/L,较野生型菌株提高了845.1%。【结论】采用随机诱变-报告基因筛选系统,可快速筛选出厦门霉素A产量大幅提升的高产菌株,为后续的药物开发奠定良好的基础。     

萤光素酶报告基因在病毒学研究中的应用

萤光素酶是一类在氧气存在下能催化其底物特异性发光的酶,检出灵敏度高、特异性强。萤光素酶催化底物发光因无须外源光的激发,避免了非特异性干扰,具有其他报告基因不可替代的优势。萤光素酶基因作为报告基因已成为医学科学研究领域的重要标记工具,具有良好的应用前景。我们简要综述了萤光素酶报告基因在病毒学研究中的应用进展。     

小鼠Daintain/AIF-1基因启动子的克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建

目的：对Daintain/AIF-1（大炎肽/同种异体移植炎症因子-1）基因启动子进行克隆并构建荧光素酶报告基因载体,为进一步研究Daintain/AIF-1的转录调控作用提供了质粒资源。方法：提取单核巨噬细胞系RAW264.7基因组DNA,以其为模板采用PCR方法克隆出Daintain/AIF-1基因5＇端UTR区1.6 kb DNA序列,将该序列同源重组到pGL3-Basic载体上,转化感受态DH5α并酶切鉴定和测序。结果：PCR产物片段与预期结果一致,Daintain/AIF-1基因5＇端UTR区1.6 kb DNA序列连接到pGL3-Basic载体上,构建成pGL3-Basic-Daintain/AIF-1（pGL3-Basic-DT）载体,酶切结果与理论预测值一致,经测序证实无碱基突变。结论：Daintain/AIF-1基因报告基因载体的构建为进一步研究Daintain/AIF-1转录调控作用提供了载体资源。