一株维氏气单胞菌发酵培养基优化及其制备疫苗免疫效力比较

采用单因素试验、响应面试验法对维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）发酵培养基的氮源、碳源、无机盐和磷酸盐成分及用量进行优化组合,确定优化培养基组成：胰蛋白胨10.8 g/L,葡萄糖5.0 g/L,牛肉膏3.0 g/L,磷酸二氢钾2.0 g/L,硫酸镁0.4 g/L,NaCl 5.0 g/L。并与基础培养基的发酵活菌数、制备的灭活疫苗免疫效力进行比较,经过验证试验绘制维氏气单胞菌在优化培养基条件下的7 L发酵罐生长曲线。在优化发酵培养基条件下,维氏气单胞菌活菌数为5.94×10⁹ cfu/mL,比基础培养基增幅43.13%;制备的灭活疫苗相对保护率为77.78%,比基础培养基提高了14.81%。7 L发酵罐发酵培养10 h,活菌数达到最大8.85×10⁹ cfu/mL。通过对发酵培养基的优化,可以获得低成本、优质高效的维氏气单胞菌发酵菌液,为今后维氏气单胞菌灭活疫苗规模化发酵培养提供参考。     

大口黑鲈白皮病病原菌的分离鉴定及药物敏感性试验

【背景】近年,广东、广西等多地养殖的大口黑鲈(Micropterus salmoides)在苗种期间极易暴发白皮病,并且与已报道的症状不同,严重危害大口黑鲈苗种的生产。【目的】确定大口黑鲈苗种白皮病的病原,通过分析生长特性、毒力因子、致病性、组织病理与敏感药物筛选试验,为该病的研究与防控提供科学参考。【方法】从患白皮病大口黑鲈的病灶处分离细菌,结合形态观察、生理生化指标、16S rRNA基因和gyrB基因序列分析等鉴定菌株;绘制菌株的生长曲线,分析温度、盐度及pH对生长的影响;采用平板法检测菌株毒力因子活性,PCR方法检测携带毒力基因的情况;通过浸泡感染试验验证菌株的致病性及其组织病理特征;采用微量稀释法测定菌株对水产常用的10种抗菌药物和6种消毒剂的敏感性。【结果】从患病的大口黑鲈白皮处肌肉分离纯化到优势菌株ZJS18004,经形态特征、生理生化特性、16S rRNA基因和gyrB基因序列分析,鉴定为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii);菌株ZJS18004的最适生长温度为30°C,最适pH值为8.0,最适盐度为5‰;在30°C时的生长曲线显示0-1 h是迟缓期,1-5...     

“观察果蝇的生殖与发育”的实验教学

黑腹果蝇作为遗传学研究中重要的模式生物,其科研价值一直备受瞩目。目前中学生物学实验教学中少有利用果蝇作为实验材料的案例,其主要原因是:果蝇培养、果蝇相关实验的具体操作在中学教材中未提供成熟的、适宜在中学实验室中操作的方法。针对上述问题,探索出了在中学实验室中进行果蝇饲养的条件,以及适合中学生的果蝇成虫麻醉方法,使果蝇成为"观察昆虫的生殖和发育"实验中较为理想的昆虫材料之一。     

一种基于lacZ基因和pUC复制子的原核启动子报告系统的构建及评价

为构建一种具有广泛适用性的原核启动子报告系统,以质粒pFLX107为骨架,通过多克隆位点替换和序列改造,构建出基于lacZ基因和pUC复制子的pFGH系列报告载体,然后以lacZ基因缺失株MC4100为宿主菌筛选背景活性最低的质粒作为最终的报告系统,并利用诱导型启动子araBAD和组成型启动子rpsM分别对其进行测试。结果显示,在所构建的pFGH系列质粒中,pFGH06的背景活性显著低于同系列其他质粒,在28 ℃培养条件下甚至显著低于低拷贝参考质粒pRCL的活性 (P<0.01)。进一步的评估测试显示,质粒pFGH06可用于诱导型启动子或组成型启动子的克隆及活性测定,且在模拟应用于启动子筛选时,通过蓝白斑筛选即可实现对目标启动子的完全识别。与已报道的原核启动子报告系统相比,pFGH06具有体积小、克隆位点多、背景活性可调、对启动子筛选识别效率高等优点,具有广泛的应用前景。     

乌鳢源杀鱼爱德华菌的分离鉴定及药敏特性研究

[背景] 江苏省扬州市某乌鳢养殖场发生疾病,给养殖户造成了严重的经济损失。[目的] 确定病因并筛选出敏感药物,为乌鳢相关疾病的防治提供参考。[方法] 从患病乌鳢体内分离致病菌,并从形态、生理生化特征、16S rRNA和gyrB基因序列及特异性PCR检测等方面对分离菌株进行鉴定,同时开展人工感染试验分析其致病性,通过纸片扩散法进行药敏特性分析。[结果] 从患病乌鳢体内分离获得优势菌株SHL,经形态特征、理化特性、16S rRNA和gyrB基因序列及特异性PCR检测鉴定为杀鱼爱德华菌。进一步人工感染试验证实其对乌鳢有较强的致病性,LD₅₀为1.6×10⁵ CFU/g,发病症状与自然发病症状相似。药敏试验结果显示,该菌株对青霉素、氯霉素、四环素等28种抗菌药物高度敏感,对红霉素中度敏感,对苯唑西啉、克拉霉素、万古霉素等6种药物耐药。[结论] 引起江苏省扬州市某养殖场的乌鳢体表溃烂及死亡的病原菌为杀鱼爱德华菌,这是我国首次从淡水鱼类中检出致病性杀鱼爱德华菌,表明该菌的感染谱在扩大,需引起水产养殖领域的重视,在养殖过程中可根据药敏实验结果选用合适的国标渔药进行防治。     

siRNA干扰对鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF57基因表达的影响

研究通过在异育银鲫脊髓细胞系(Spinal cord tissue cell lines of Carassius auratus gibelio, CSC)中对鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2, CyHV-2) ORF57进行RNA干扰, 以探究其对CyHV-2病毒复制的影响。首先, 以FAM标记的异育银鲫β-actin的siRNA进行CSC细胞转染条件的优化, 再将针对CyHV-2 ORF57基因设计的3条siRNA, 转染CSC细胞, 并进行病毒感染, 评估siRNA对病毒复制和致细胞病变的影响。转染条件优化结果显示, 在siRNA浓度为80 nmol/L, 转染液维持24h后更换维持液, β-actin基因表达量最低且观察到的荧光点数量最多。而ORF57-siRNAs干扰结果显示, ORF57-siRNA-2组表现出了较强的抑制效果, 在接毒48h时, ORF57-siRNA-2处理组的ORF57基因表达量降到相对于Mock组的33.55% (P<0.01), 并且各ORF57-siRNA组都表现出了延缓CyHV-2致细胞病变的时间和强度, 抑制时间可达120h。TCID₅₀结果显示, 不同组的ORF57-siRNAs均能降低病毒滴度, 其中ORF57-siRNA-2将病毒原液TCID₅₀ 108.487/mL下降至106.776/mL。研究结果表明, 干扰ORF57的表达可大大降低CyHV-2的致细胞病变力和复制率, ORF57在CyHV-2复制与致细胞病变中起重要作用。本研究为CyHV-2基于siRNA技术的抗病毒治疗和弱毒株的改造提供了借鉴。     

弧菌外膜蛋白ompk工程菌规模化培养表达初探

目的:为Ompk亚单位疫苗生产提供参数。方法:利用振荡和发酵培养,测定不同培养时间的菌液浊度和蛋白诱导表达效果。结果:工程菌30℃摇瓶培养10h,种子罐培养8～10h,较为合适;摇瓶和5L发酵罐诱导表达培养,升温42℃诱导表达,7h效果较佳;经5批次50L、500L发酵罐诱导表达培养,均可得到重组蛋白表达的工程菌体,50L和500L发酵罐最高生物量分别为5.32g/L和6.38g/L,平均可达到3.75 g/L和4.74 g/L;适当延迟升温诱导前的培养时间,可提高工程菌的得率。结论:初步确定了重组蛋白工程菌规模化诱导表达培养方法,利用500L发酵罐培养可得到诱导表达的工程菌体。     

哈氏弧菌EcGY020401优化培养

目的:为规模化制备弧菌疫苗提供相关数据.方法:利用摇瓶和小型发酵罐培养,通过平板计数测定培养菌液的活菌数.结果:哈氏弧菌(Vibrio harveyi)EcGY020401株最适盐度为20～25g/L,合适的pH为7.5～7.7,葡萄糖浓度最适浓度为2～5g/L,用TSB优化培养基:胰蛋白胨5g/L、蛋白胨15g/L、大豆蛋白胨3g/L、酵母膏1g/L、葡萄糖4g/L、磷酸氢二钾5g/L、氯化钠15g/L、pH 7.5,培养EcGY020401菌株,可达2.95×1010 cfu/mL;小型发酵罐培养,10h可达到生长最大值,菌液浓度为3.46×1010cfu/mL 结论:用优化TSB培养基,采用发酵罐培养弧菌,可降低成本,提搞培养效率.     

弧菌菌株发酵工艺初步研究

采用摇瓶培养和发酵罐培养并在不同培养时间测定菌液浊度和活菌数,为弧菌灭活疫苗生产工艺提供参数.研究结果表明,摇瓶培养装量以30%较为合适,培养基初始pH 7.5,发酵过程以不再控制为宜.初步确定了弧菌发酵培养工艺参数:弧菌菌株接种TSB,28 ℃摇瓶培养18～20 h,28 ℃种子罐通气搅拌培养12～14 h,28 ℃...     

鱼源溶藻弧菌生物学特性和病理组织学观察

【目的】溃烂病是我国海水养殖及南方养殖斜带石斑鱼的常见严重病害之一。通过对患病的斜带石斑鱼病原菌的分离与鉴定,为检测其耐药性和控制石斑鱼在海水养殖中溃烂病的爆发和流行奠定基础。本文目的是研究斜带石斑鱼相关的病原菌的特性。【方法】从患病斜带石斑鱼肾脏、肝脏病灶组织,分离纯化得到病原菌,进行纯化培养、人工感染和回归感染、ATB细菌自动鉴定及药敏试验,并进行菌体常规形态特征、培养特性和生理生化反应指标测定。【结果】确定为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)。两株典型菌株经人工感染和回归感染均显示自然发病症状。药敏试验表明,该菌具有较强的耐药性,在所检测的抗菌药物中,对青霉素等3类抗菌药物高度耐药,而对氯霉素等5类抗菌药物敏感。器官主要组织病理学变化为:肝细胞、肾小管细胞等变性、坏死,病变组织有炎性细胞浸润且呈变质性炎症。溶藻弧菌对机体的主要器官造成严重病理损伤。【结论】生理生化等结果均证实分离菌株是溶藻弧菌,而且产生多重耐药情况较为普遍,未来应加强对养殖海水中病原耐药性和斜带石斑鱼病原感染的监测。