利用大肠杆菌高效表达人载脂蛋白AI及其性质分析

载脂蛋白AI(apolipoproteinAI,apoAI)是高密度脂蛋白HDL的主要组成成分 ,流行病学研究表明apoAI的含量决定血浆中HDL的高低 ,而HDL具有胆固醇逆向转运的功能 ,起到降低冠心病发生概率的作用。通过大肠杆菌表达系统来生产apoAI的蛋白原proapoAI,蛋白的表达形式为包涵体 ,通过疏水柱进行柱上复性。同时在proapoAI和apoAI之间设计一个酸水解位点 ,通过将蛋白原proapoAI进行酸水解来得到成熟蛋白apoAI。最终得到的成熟蛋白apoAI在结构分析和脂结合特性上都与天然的apoAI相似 ,从而为该蛋白的工业生产上提供了一个良好的基础。     

人apoA-Ⅰ基因启动子转录上调剂筛选系统的建立与应用

PCR扩增含有apoA-Ⅰ基因的转录调控序列的启动子片断（376 bp）,克隆入含有荧光素酶报告基因和新霉素抗性基因的pGL3B-neo载体中,构成受apoA-Ⅰ启动子调控的重组报告基因质粒pGL3B-neo：：apo,稳定转染人肝癌细胞株HepG2。通过细胞有限稀释法筛选稳定表达荧光素酶活性的细胞株SAPOA-Ⅰ。经apoA-Ⅰ转录调控因子PPARα激动剂的鉴定和细胞接种密度、溶剂使用浓度等条件的优化,成功建立了靶向apoA-Ⅰ基因启动子转录活性的报告基因筛选体系。应用该体系对400多种降脂中药提取物进行筛选,泽泻、罗布麻叶、山楂等提取物显示出较好的上调活性,与文献报道采用动物模型研究的结果一致。     

金叶子中抑制膜结合型PGE2合酶-1表达活性物质的分离与鉴定

在从天然产物筛选抗炎物质的过程中,应用有机溶媒萃取、浓缩及层析分离纯化后,从金叶子中得到三个化合物:槲皮素(1)、番石榴苷(2)、栎素(3).化合物2为首次从此植物中分离鉴定,化合物1显示了强烈的抑制mPGES-1基因表达的活性,其IC50值为35.40μg/mL.     

基于选择性抑制mPGES-1的表达筛选抗炎中药

通过建立的选择性膜型前列腺素E2合酶-1(mPGES-1)表达抑制剂的体外细胞筛选模型,对50味中药共236个样品进行筛选。初筛中,筛选中药不同极性提取物对mPGES-1表达的抑制作用,抑制率50%的样品进入复筛;复筛中,检测初筛活性样品对环氧化酶(COX)-1和COX-2表达的抑制作用,抑制率均20%的样品认为是阳性物。结果表明,吲哚美辛对3种酶的抑制活性与文献报道相近;筛选发现泽泻组分1、蒲黄组分2对mPGES-1的表达有可重复的选择性抑制作用,对泽泻组分1、蒲黄组分2进行进一步研究,有望确定其抗炎的有效部位或化合物。     

人apoA-I基因启动子转录上调剂筛选系统的建立与应用

PCR扩增含有apoA-I基因的转录调控序列的启动子片断(376 bp),克隆入含有荧光素酶报告基因和新霉素抗性基因的pGL3B-neo载体中,构成受apoA-I启动子调控的重组报告基因质粒pGL3B-neo::apo,稳定转染人肝癌细胞株HepG2。通过细胞有限稀释法筛选稳定表达荧光素酶活性的细胞株SAPOA-I。经apoA-I转录调控因子PPARα激动剂的鉴定和细胞接种密度、溶剂使用浓度等条件的优化,成功建立了靶向apoA-I基因启动子转录活性的报告基因筛选体系。应用该体系对400多种降脂中药提取物进行筛选,泽泻、罗布麻叶、山楂等提取物显示出较好的上调活性,与文献报道采用动物模型研究的结果一致。     

重组人载脂蛋白AI米兰变体在大肠杆菌中的高效表达

通过大肠杆菌表达系统来生产重组人载脂蛋白AIM(proapolipoprote in AIM,proapoAIM)。整个proapo AIM基因被分成两个片断,通过RT-PCR的方法合成。在对该基因的上游部分进行改造后,插入到表达载体pBV220中进行表达。蛋白的表达量达到45%左右,蛋白的表达形式为包涵体。包涵体通过疏水柱进行柱上复性,复性后的蛋白具有良好的生物活性。