值得重视的新型酶试剂-萤光素酶

六十年代在研究萤火虫尾部发光机理中,发现了萤光素酶。之后人们又发现了许多结构上差异很大的多种萤光素酶。但研究最多的是萤火虫产生的萤光素酶和由海洋发光细菌产生的萤光素酶。它们所催化的底物——萤光素的结构非常不同,前者为6—羟基苯并噻唑,而后者为脂肪醛。     

Gaussia分泌型萤光素酶的研究进展及其应用

Gaussia分泌型萤光素酶是近年发现的一种来源于海洋桡脚类动物Gaussia princeps的新型分泌型萤光素酶,是目前已知的可自然分泌的最小萤光素酶,因其分子小、灵敏度高、半衰期短和可高效分泌,而成为一种理想的报告基因,广泛应用于体内外研究。我们就Gaussia分泌型萤光素酶的发光原理、荧光特性及其应用等进行简要综述。     

用于筛选shRNA的新型双萤光素酶报告基因载体的构建及应用

目的:构建一个新型双萤光素酶报告基因载体用于准确高效地筛选有效抑制靶基因表达的shRNA。方法:采用PCR、定向克隆、基因重组等分子生物学方法,将双萤光素酶报告基因系统中需要的报告基因载体、shRNA真核表达载体和内参载体三个功能,整合于一个新型的双萤光素酶报告基因载体pFLuc-C-TK-RLuc-shRNA之中。应用该载体对靶向人PD1基因以及Furin基因的shRNA进行干涉效果比较。结果:应用p FLuc-C-TK-RLuc-shRNA载体进行单质粒转染方法与传统的三质粒转染方法均提示shRNA#1对靶基因PD1的抑制效果最优;但是使用新型双萤光素酶报告基因载体检测结果的标准差数值显著低于传统方法。以pFLuc-C-TK-RLuc-shRNA单质粒转染方法得到的各组样品结果的均一性显著提高,能够准确地反映出shRNA#3较shRNA#2具有更强的Furin基因抑制作用;而传统方法未能有效判断二者的差异。结论:新型双萤光素酶报告基因载体简化了操作步骤,降低了传统三质粒共转染方法所引起的检测结果大幅波动,进一步增强了双萤光素酶报告基因系统的信噪比,提高了筛选抑制靶基因表达shRNA的准确性。     

表达萤光素酶的HIV药物筛选细胞模型的建立

目的:构建基于萤光素酶的单次复制人免疫缺陷病毒(HIV)细胞模型,用于抗HIV药物的筛选。方法:构建含萤光素酶报告基因的假型慢病毒质粒,将疱疹性口炎病毒外膜糖蛋白(VSV-G)的表达质粒、HIV-1 Rev蛋白表达质粒、HIV Gag-Pol蛋白表达质粒和含萤光素酶报告基因的重组慢病毒质粒共转染HEK 293FT细胞,制备假型慢病毒;在假型慢病毒生产和再感染新鲜HEK 293FT细胞的过程中加入逆转录酶和蛋白酶抑制剂(如AZT),检测再感染的细胞中萤光素酶的表达水平,从而判断药物对HIV的抑制作用。结果:构建了含萤光素酶报告基因的重组慢病毒质粒pLenti-Luc;利用已知抗HIV药物AZT进行测试,发现HIV药物处理组细胞中萤光素酶活性远低于对照组。结论:建立了基于萤光素酶的HIV药物筛选细胞模型,该系统使用单次复制的报告病毒,具有良好的安全性,而使用萤光素酶基因作为报告基因使该系统具备极高的敏感性,该系统适合于进行高通量药物筛选。     

含分泌型萤光素酶和绿色荧光蛋白双报告基因的慢病毒载体的制备与表达分析

目的:制备含分泌型萤光素酶和绿色荧光蛋白双报告基因的慢病毒载体,为慢病毒载体的进一步广泛应用奠定基础。方法:克隆构建含分泌型萤光素酶和绿色荧光蛋白双报告基因的转基因载体pCS-gluc-2A-eGFP,酶切与序列分析鉴定其正确后,与包装质粒pCMVHR’Δ8.2、包膜质粒pVSV-G共转染293FT细胞,获得含分泌型萤光素酶和绿色荧光蛋白双报告基因的重组慢病毒载体;重组慢病毒载体感染A549、Huh7细胞后,用荧光显微镜直接观察报告基因GFP的表达,或取细胞上清实时检测分泌型萤光素酶的表达。结果:制备了含双报告基因的重组慢病毒载体,感染细胞后可以活体观察绿色荧光蛋白的表达,也可以快速灵敏地检测到分泌型萤光素酶的表达。结论:所获含分泌型萤光素酶和绿色荧光蛋白双报告基因的重组慢病毒载体感染效率高,表达易于活体实时检测,灵敏度高。本研究为慢病毒载体的广泛应用奠定了基础。     

雄激素应答元件假冒DNA对PSA基因启动子的抑制作用

研究雄激素应答元件假冒DNA(AREdecoy)对前列腺特异抗原 (PSA)基因启动子的抑制作用 .联合运用报告基因和假冒DNA策略 ,构建了含PSA基因 5′侧启动子区 6 40bpDNA的萤光素酶表达载体pGL3 PSA ,与人工合成的双链硫代ARE假冒DNA共转染前列腺癌细胞株PC3 M并作用不同的时间 (2 4h、4 8h、72h) .应用双萤光素酶测定系统 ,检测萤光素酶的表达活性 .结果显示 :AREdecoyDNA显著抑制报告基因萤光素酶的表达 ,抑制率可达 95 % ,而对照decoyDNA无此作用 .作用不同的时间对萤光素酶活性的抑制无显著性差异     

cAMP反应元件萤光素酶报告基因载体的构建简

目的：构建含有cAMP反应元件（CRE）的萤光素酶报告基因载体。方法：以含有ga14位点的萤光素酶报告基因质粒为模板,利用PCR方法,在去除ga14位点的同时,连入4个CRE元件得到pCRE-luc;将该载体与G蛋白偶联受体（GPCR）共转染人胚肾细胞HEK293,测定萤光素酶活性;应用蛋白激酶A（PKA）抑制剂确认CRE的活性是否与Gs通路相关。结果：pCRE-luc的活性直接相关于GPCR的激活程度,并依赖Gs信号通路。结论：CRE萤光素酶报告基因载体构建成功,可用于检测Gs偶联GPCR的活性,为基于GPCR的高通量药物筛选奠定了基础。     

cAMP反应元件萤光素酶报告基因载体的构建

目的:构建含有cAMP反应元件(CRE)的萤光素酶报告基因载体。方法:以含有gal4位点的萤光素酶报告基因质粒为模板,利用PCR方法,在去除gal4位点的同时,连入4个CRE元件得到pCRE-luc;将该载体与G蛋白偶联受体(GPCR)共转染人胚肾细胞HEK293,测定萤光素酶活性;应用蛋白激酶A(PKA)抑制剂确认CRE的活性是否与Gs通路相关。结果:pCRE-luc的活性直接相关于GPCR的激活程度,并依赖Gs信号通路。结论:CRE萤光素酶报告基因载体构建成功,可用于检测Gs偶联GPCR的活性,为基于GPCR的高通量药物筛选奠定了基础。     

人TANK结合激酶1的基因克隆、表达及生物活性鉴定

目的:克隆人TANK结合激酶1(TBK1)基因,构建其真核表达载体,检测该基因在293细胞中的表达,并利用萤光素酶报告基因实验检测其生物活性。方法:应用RT-PCR方法,以HeLa细胞RNA为模板,扩增获得TBK1基因,定向克隆到pcDNA3-Flag载体中,以LipofectAMINE2000转染试剂转染pcDNA-Flag-TBK1至293细胞中进行瞬时表达,并利用萤光素酶报告基因实验检测诱导β干扰素(IFN-β)转录的情况。结果:测序结果表明,从人HeLa细胞总RNA中克隆到正确的TBK1基因全长编码序列,利用Western印迹检测其在293细胞中获得有效表达,利用萤光素酶报告基因实验检测TBK1可以诱导IFN-β转录激活。结论:真核表达的人TBK1具有相应的生物学活性,为研究其功能奠定了基础。     

发光的魚

栖息在海洋的鱼类尤其是海底的鱼,常发现有发光的现象。这些鱼能发出红色或紫色的宝石状的光芒。这些鱼在体中含有发光体的机构,通过半透明的肌肉,发出光来。若把这些发光体和体表的发光器制成匀浆来培养不能发光的细菌或喂饲其他不发光的鱼类,我们可在细菌或鱼类的胃中分析出萤光素和萤光酶,在这些鱼类的幽门部中贮藏着萤光素,看来在发光器中还备有萤光酶,从幽门部把少量的萤光素送到发光器,它与萤光酶起作用便射出光芒。看来,发光