基于PCR DGGE的小鼠肠道菌群基因组提取方法的建立

通过比较4种小鼠粪便细菌总DNA提取方法对基于PCR-DGGE检测的肠道菌群多样性分析的影响,旨在建立适于PCR—DGGE的小鼠肠道微生物宏基因组提取的稳定、经济、快捷的方法。采用SDS裂解法、某国产市售粪便DNA提取试剂盒、改进的化学裂解法、改进的溶菌酶法4种方法提取小鼠粪便细菌总DNA,通过琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度法、细菌16S rRNAV3区PCR扩增结合DGGE对提取结果进行比较分析。SDS裂解法和国产市售试剂盒2种方法提取粪便细菌总DNA均未得到理想结果,另2种方法均能够检测到粪便中20种左右的细菌。改进的化学裂解法和改进的溶菌酶提取法的建立为基于PCR—DGGE进行肠道菌群结构的定量及定性分析提供了可靠的前提基础和实验保障。     

蕨菜乙醇提取物的Ames试验研究

目的：研究蕨菜乙醇提取物的致突变作用,为蕨菜的开发利用提供一定依据;方法：制备蕨菜乙醇提取物,采用Ames试验方法,以50μg/皿敌克松作为诱变剂,分别添加提取物50、100、200、400、800μg/皿,统计回变菌落数;结果：受试物各剂量组回变菌落数均未超过自发回变菌落数的2倍,且无剂量-反应关系;结论：在本实验条件下,蕨菜乙醇提取物无致突变作用.     

撰写要求

1文稿应具科学性、实用性,论点明确,资料可靠,数据准确,层次清楚,文字精练,用字规范,必要时应作统计学处理。提倡多附图像清晰的插图,数量不限。论著性文章4000字左右（一般不超过5000字）,并附400字左右的中英文摘要（含英文文题、工作单位和汉语拼音书写的全部作者姓名）。综述、讲座5000字左右。论著摘要、经验交流、病例报告等一般不超过2000字。专家多媒体讲座为30min,手术或实验操作演示视频时长15分钟左右。当文稿的主体是以人为研究对象的试验时,作者应该说明其遵循的程序是否符合负责人体试验委员会（单位性的、地区性的或国家性的）所制定的伦理学标准,并提供该委员会的标准文件及受试对象或其亲属的知情同意书。     

抗 DR5单克隆抗体 ELISA 检测新方法的建立

目的:建立一种灵敏、特异、快速的 ELISA 方法,用猕猴血清中抗死亡受体5(DR5)单克隆抗体的检测.方法:采用双抗夹心 ELISA 法,用猴血清吸附的羊抗人 IgG 包被96孔酶标板,加入待测样品,用 HRP 标记的猴血清吸附的羊抗人 IgG 进行检测,加底物显色,读取 D450nm值.结果:建立了检测抗 DR5单克隆抗体的 ELISA 方法并进行了确证,方法的线性范围为12.5~800 ng/mL,定量下限为12.5 ng/mL,板内和板间精密度均小15%,准确度为±15%,冻融稳定性和稀释稳定性良好.结论:方法学确证结果表明,本研究建立的抗 DR5单克隆抗体检测方法符合新生物制品临床前药代动力学研究指导则要求,可用抗 DR5单克隆抗体的检测.     

地黄SCoT分子标记体系的建立和指纹图谱的构建

该研究采用L_(25)(5~6)正交设计和单因素两种方法,对影响地黄SCoT-PCR反应的5个因素(模板DNA浓度,引物浓度,ddH_2O和Mix的用量以及退火温度)进行了优化。结果表明:优化后的反应体系总体积为25μL,含有8μL ddH_2O,1μL模板DNA(80 ng·μL~(-1)),1μL引物(8μmol·L~(-1))和15μL Mix,退火温度为45℃。运用30份地黄种质材料,对优化的SCoT-PCR正交体系进行多次重复验证,获得了多态性丰富、条带清晰的扩增图谱,证明该反应体系稳定可靠。利用该体系对32条SCoT引物进行两次筛选,得到14个扩增产物清晰、重复性好且多态性条带相对较高的引物。利用SCoT_4等5条引物构建了上述地黄2个种共30份种质的SCoT指纹图谱。利用这5个SCoT引物指纹图谱可将7个地黄常用栽培品种区分开。这表明SCoT分子标记体系适用于地黄主要品种亲缘关系及遗传多样性的研究,所构建的指纹图谱也为地黄常见的7个栽培品种的区分提供参考依据。     

一株高产Monacolin K紫红曲霉菌株筛选、鉴定及发酵条件优化

为从天然发酵红曲米中分离的30株红曲霉菌株中筛选高产MonacolinK的菌株,并对其产MonacolinK的发酵条件进行优化。实验采用高效液相色谱法(HPLC)筛选到9株具有产MonacolinK能力的红曲霉菌株,其中以编号ZX26的菌株产MonacolinK能力最高,发酵液中Monacolin K产量达到107.6mg/L,并且产MonacolinK能力具有良好的稳定性。微生物形态学结合ITS基因同源性分析结果表明,编号ZX26菌株为紫红曲霉。进一步采用单因素试验和正交试验法优化紫红曲霉ZX26产MonacolinK的发酵条件,结果表明在培养基组分为葡萄糖70g/L,牛肉膏15g/L,NaNO32g/L,MgSO4·7H2O0.5g/L,KH2PO41.5g/L时,其最优发酵条件为:发酵初始pH4.0,接种量为7%,培养温度30℃,发酵10天,在此条件下,紫红曲霉ZX26发酵液中MonacolinK产量达到271.36mg/L,相对于培养条件优化前MonacolinK产量提高152.19%,经验证此培养条件下MonacolinK产量最佳。     

极端耐盐碱菌株的筛选及其菌肥对盐碱条件下小麦生长和土壤环境的影响

为获得具有盐碱地改良应用潜力的耐盐碱菌株,将采集于东营盐碱地的土样稀释涂布于pH 9、盐浓度100 g·L-1的Gibbson改良培养基上,共获得18株细菌.通过提高盐浓度、pH值,最终获得在pH 12、盐浓度20%的条件下仍然可以生长的极端耐盐碱菌株N14.对N14进行形态学、生理生化特征和16S rDNA序列分析鉴定,结果表明:菌株N14为马氏芽孢杆菌.盆栽试验结果表明,与盐碱土(CK)相比,N14菌肥可以显著提高小麦的生物量,株高、鲜重、干重分别提高了21.8%、57.9%、41.7%;显著增加小麦叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总量,增长率分别为36.4%、20.0%、31.7%;显著提高盐碱土壤中的蔗糖酶、脲酶和碱性磷酸酶的活性,增长率分别为23.2%、68.8%、106.5%;显著提高小麦根系的超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶的活性,增长率分别为109.6%、17.8%、50%;显著减少小麦根系丙二醛的含量,减少率为39.8%.本研究为极端耐盐碱菌的应用提供了一条新思路,为盐碱地的改良提供了一条新途径.     

布比卡因致心肌细胞线粒体损伤大鼠模型的建立

目的观察电刺激下布比卡因心肌细胞线粒体形态变化及活性氧(reactive oxygen species, ROS)生成量,探讨建立理想的布比卡因中毒的大鼠心肌细胞模型。方法采用Langendroff装置新鲜分离雄性SD大鼠心肌细胞,细胞计数后将其转移至doff管中随机分为四组:DMEM静置组、DMEM电刺激组、布比卡因静置组、布比卡因电刺激组。实验重复五次。采用透射电镜观察心肌细胞线粒体形态,并使用多功能微孔板检测仪测量ROS生成量。结果 DMEM电刺激组线粒体肿胀程度及ROS生成量与DMEM静置组相比差异无显著性(P> 0.05);而布比卡因电刺激组线粒体肿胀程度明显高于布比卡因静置组(P=0.000),且ROS生成量也明显升高(P<0.05)。结论电刺激下心肌细胞呈节律性收缩,能更好地模拟临床布比卡因中毒时心肌线粒体损伤。     

人源抗狂犬病病毒单克隆抗体的构建及验证

目的利用人源抗狂犬病病毒ScFv噬菌体抗体库,构建单克隆抗体(单抗)轻、重链质粒,瞬时表达,纯化后验证具有高中和活性的单抗。方法以从ScFv噬菌体抗体库中筛选获得特异性抗体为模板,PCR扩增抗体轻、重链可变区序列,构建人源全分子抗体瞬时转染质粒;轻、重链质粒混合后转染HEK293 EBNA1细胞,瞬时表达全分子抗体。采用Mabselect SuRe介质手动亲和纯化抗体,Nano Vue超微量分光光度计测定蛋白质的质量浓度,快速荧光灶抑制试验(rapid fluorescent focus inhibition test, RFFIT)进行体外中和效价验证。结果成功构建22个轻链质粒,15个重链质粒。通过真核细胞瞬时表达后,经手动亲和纯化后,获得22株单抗。除1株抗体外,其余21株抗体的蛋白质量浓度均>300μg/mL;部分抗体纯度均在90%以上。中和活性结果显示,5株在1 500~1 800 IU/mg之间;8株在800~1 500 IU/mg之间;7株在500~800 IU/mg之间;其余2株在500 IU/mg以下。结论成功构建并验证获得20株中和活性>500 IU/mg的人源抗狂犬病病毒单抗,为单抗混合制剂的研究奠定了基础。