定量比格犬血浆中去甲文拉法辛LC-MS/MS方法的建立及比格犬血浆中富马酸去甲文拉法辛药代动力学研究

目的:建立一种快速灵敏的液质联用方法定量比格犬血浆中去甲文拉法辛,并进行比格犬体内富马酸去甲文拉法辛药代动力学研究,同时与琥珀酸去甲文拉法辛比格犬体内药代参数进行对比。方法:样品处理采用叔丁基甲醚进行液液萃取,液相分离采用Agilent Eclipse Plus C18色谱柱(2.1 mm×100 mm,3.5μm),以乙腈-乙酸铵缓冲液(1 mmol/L)(体积比80∶20)进行等度洗脱。采用单次给药和多次给药试验进行比格犬体内药代动力学研究。结果:此方法具有良好的线性、精密度、准确度,定量下限(0.5 ng/mL)高于文献报道。液液萃取的样品提取方法简便,液质联用分析时间相对较短(3 min)。结论:此方法可成功地应用于比格犬血浆中去甲文拉法辛定量分析。比格犬体内富马酸去甲文拉法辛的药代参数(单次给药和多次给药试验)与对照品琥珀酸去甲文拉法辛没有明显的统计学差异。     

定量检测 IL-2-HSA 融合蛋白双抗体夹心 ELISA 法的建立

目的:通过抗体配对方法,建立能高特异、高灵敏地定量检测食蟹猴体内 IL-2-HSA 融合蛋白浓度的双抗体夹心 ELISA 法.方法:以 IL-2单克隆抗体为包被抗体、IL-2-HSA 融合蛋白为夹心抗、生物素标记的 HSA 为检测抗体,一抗和二抗的工作浓度分别为8μg/mL 和1∶5000,HRP 标记的亲和素为1∶200.结果:IL-2-HSA 融合蛋白标准品的曲线范围为3.9~250 ng/mL,最低检测限为3.9 ng/mL,与 IL-2、HSA、GLP-1/HSA 和 CD20单抗均无交叉反应,方法的回收率为98.9%~101.5%,批内和批间准确度分别为96.1%~98.3%和93.9%~105.4%.结论:本方法符合新生物制品临床前药代动力学研究指导则的要求,可用 IL-2-HSA 融合蛋白在临床前药代动力学试验的定量检测.     

抗 DR5单克隆抗体 ELISA 检测新方法的建立

目的:建立一种灵敏、特异、快速的 ELISA 方法,用猕猴血清中抗死亡受体5(DR5)单克隆抗体的检测.方法:采用双抗夹心 ELISA 法,用猴血清吸附的羊抗人 IgG 包被96孔酶标板,加入待测样品,用 HRP 标记的猴血清吸附的羊抗人 IgG 进行检测,加底物显色,读取 D450nm值.结果:建立了检测抗 DR5单克隆抗体的 ELISA 方法并进行了确证,方法的线性范围为12.5~800 ng/mL,定量下限为12.5 ng/mL,板内和板间精密度均小15%,准确度为±15%,冻融稳定性和稀释稳定性良好.结论:方法学确证结果表明,本研究建立的抗 DR5单克隆抗体检测方法符合新生物制品临床前药代动力学研究指导则要求,可用抗 DR5单克隆抗体的检测.     

雷诺嗪缓释片在比格犬体内的药代动力学

目的:研究雷诺嗪缓释片在比格犬体内的药物代谢动力学,并与参照制剂比较,为其是否具有缓释特征提供依据。方法:首先建立血浆中雷诺嗪浓度的液相色谱-串联质谱联用检测方法,并考察方法的专属性、准确度、日内日间精密度、回收率、线性范围等。采用随机对照试验设计,将12只比格犬随机分为A、B组,每组6只,分别服用1片雷诺嗪缓释片(500 mg/片)和1片参比制剂雷诺嗪片(500 mg/片),均于给药前和给药后不同时间点采集血样,用已建立的液质联用方法检测血样中雷诺嗪的血药浓度,计算2组比格犬的药代动力学参数。结果:受试组和参照组半衰期t1/2分别为13.3±8.3和2.36±0.92 h,峰浓度Cmax分别为923.9±340.5和3205±1314 ng/mL,达峰时间Tmax分别为1.6±0.38和0.88±0.14 h,曲线下面积AUC0~∞分别为6252.1±2860.3和9916±4305(ng·h)/mL,清除率Cl分别为11.3±9.8和6.39±3.95 L/(kg·h)。受试制剂雷诺嗪缓释片和参比制剂雷诺嗪片的药代特征和血药浓度-时间变化趋势明显不同,受试组血药浓度缓慢上升和下降,峰值较低;而参照组血药浓度峰值显著高于受试组,有明显的突释效应。结论:液质联用检测方法准确可靠,适合体内药代动力学研究;与参比制剂雷诺嗪片相比,受试制剂雷诺嗪缓释片符合缓释片的基本药代动力学特点。     

定量检测猕猴血清中重组人源化抗狂犬病毒单克隆抗体间接ELISA法的建立

目的：建立定量检测血清中重组人源化抗狂犬病毒单克隆抗体（HuMabs）NM57的间接ELISA法,为药代动力学研究提供一种简单快速的方法。方法：采用狂犬病毒糖蛋白包被酶标板、HRP标记的IgG-Fc段为标记抗体,建立定量检测HuMabsNM57的间接ELISA法,并对其特异性、灵敏度、精密度及准确度进行检测。结果：间接ELISA法检测HuMabsNM57的灵敏度为5ng／mL,组内及组间精密度分别为2．6％-6．0％、8．5％-11．3％。结论：建立了灵敏度高、特异性强的检测HuMabs NM57的间接ELISA法,精密度及准确度均符合药代动力学要求,可用于猕猴及人血清中HuMabsNM57的检测。     

重组抗CD20单克隆抗体ELISA检测新方法的建立

目的:建立一种检测重组抗CD20单克隆抗体的新的ELISA方法,以便快捷、简便、灵敏地检测生物体液中的重组抗CD20单抗。方法:采用双抗夹心ELISA法对重组抗CD20单克隆抗体进行定量检测,包被抗体用猴血清吸附的羊抗人IgG,检测抗体用猴血清吸附的羊抗人IgG-HRP,最后加底物显色剂,终止后在酶标仪450 nm下读数。结果:按照新药临床前药代动力学中方法学确认的要求进行验证,获得了检测重组抗CD20单克隆抗体的高灵敏度和稳定的ELISA方法。结论:该ELISA方法简便、稳定、灵敏度高,可用于重组抗CD20单克隆抗体的检测。     

检测恒河猴血清中trastuzumab浓度的一种直接酶联免疫竞争法

采用ELISA法建立检测恒河猴血清中trastuzumab的酶联免疫竞争法,为研究人体内trastuzumab的药物动力学学和药效学提供依据。方法的测量范围是1～100μg／mL,最低检测限为1．0μg／mL。板内精密度范围91％～107％,相对标准偏差为1．5％～4．9％。板间精密度范围102％～110％,相对标准偏差为2．7％～15．4％。方法中未显示与重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白、重组抗CD20单克隆抗体、丙种球蛋白等的交叉反应。此方法的特异性、灵敏度、精密度和准确度均满足恒河猴血清样品的分析,是检测猴和人体内trastuzumab的理想方法。     

用BIAcore系统研究西妥昔单克隆抗体与表皮生长因子受体的结合

目的：应用基于表面等离子体共振技术的BIAcore3000系统研究国产西妥昔单克隆抗体（cetuximab）C225与可溶性重组人表皮生长因子受体（EGFR）的结合能力,并与国外已上市的西妥昔单抗Erbitux相比较。方法：在CM5传感器芯片上设置2个通道,一个氨基偶联重组人EGFR作为检测通道,另一个不固定EGFR作为空白参比通道;以HBS溶液作为工作液,流速为10μL／min;活化与封闭芯片;再以10μL／min的流速分别以梯度浓度进样C225和Erbitux,每个浓度级别检测2次;获得结合动态图谱,拟合处理后用软件模块进行参数计算。结果：C225与可溶性重组人EGFR的结合动力学常数K^为4．00×10^8L／mol,KD为2．50×10^-9mol／L;而Erbitux与可溶性重组人EGFR的结合动力学常数KA为4．25×10^8L／mol,KD为2．35×10^-9mol／L。结论：在与可溶性重组人EGFR的结合能力上,C225与Erbitux有相似的结合动力学特性。     

抗体偶联小分子药物T-DM1的ELISA检测方法的建立

目的:建立一种灵敏、特异、快速的ELISA方法,用于检测猕猴血清中T-DM1的含量。方法:采用双抗夹心ELISA法对T-DM1进行定量。以DM1单抗作为一抗包被到96孔板中,加入待检样品,之后再加入稀释好的猴血清吸附的羊抗人IgG-HRP(二抗),使之与结合到一抗上的T-DM1特异性结合,加底物显色,在酶标仪上读取D450nm值。结果:建立了检测T-DM1的ELISA方法并得到确证,方法的线性范围为0.625~80 ng/mL,定量下限为0.625 ng/mL,板内及板间精密度和准确度均在±15%以内,室温、冻融、稀释效应稳定性良好。结论:方法学验证表明ELISA法测定猴血清中T-DM1浓度的特异性、精密度和准确度均满足新生物制药临床前药代动力学研究指导原则要求,可用于T-DM1的检测。     

重组人血清白蛋白抗体检测方法的建立及确证

目的：建立一种高灵敏度、高特异性、操作简单快捷、通量高的重组人血清白蛋白（rHSA）抗体检测方法。方法：采用桥连ELISA法,即将rHSA包被于96孔板,加入待测血样及阳性对照,用辣根过氧化物酶标记的rHSA检测,显色读取D_450nm/D_570nm值：用此方法确定临界值、方法灵敏度、精密度、血药浓度对检测方法的影响,再以免疫清除法进行确证。结果：通过桥连ELISA法确定临界值为0．0492,方法灵敏度为352ng／mL,方法板间、板内精密度均小于20％,且血药中的rHSA浓度为20μg／mL时不影响抗体的检测;经免疫清除法可将假阳性样本排除,从而提高了方法的特异性．结论：建立的方法可以准确、快速地检测出rHSA的特异性抗体。