重组抗CD52人源化单克隆抗体ELISA检测方法的建立

目的:建立一种灵敏、特异、快速的ELISA方法,用于检测食蟹猴血清中重组抗CD52单克隆抗体的含量。方法:采用双抗夹心ELISA法对重组抗CD52单克隆抗体进行定量。以猴血清吸附的羊抗人Ig G作为包被抗体,稀释的猴血清吸附的羊抗人Ig G-HRP(二抗)作为检测抗体,加入底物显色剂后在酶标仪上读取D450nm值。结果:建立并确证了检测重组抗CD52单克隆抗体的ELISA方法,方法的线性范围为7.81~500 ng/m L,定量下限为7.81 ng/m L,板内及板间精密度和准确度均在±15%以内,室温、冻融、稀释效应稳定性良好。结论:方法学验证表明ELISA法测定食蟹猴血清中重组抗CD52单克隆抗体浓度的特异性、精密度和准确度均满足新生物制药临床前药代动力学研究指导原则要求,可用于重组抗CD52单克隆抗体的检测。     

重组抗CD20单克隆抗体ELISA检测新方法的建立

目的:建立一种检测重组抗CD20单克隆抗体的新的ELISA方法,以便快捷、简便、灵敏地检测生物体液中的重组抗CD20单抗。方法:采用双抗夹心ELISA法对重组抗CD20单克隆抗体进行定量检测,包被抗体用猴血清吸附的羊抗人IgG,检测抗体用猴血清吸附的羊抗人IgG-HRP,最后加底物显色剂,终止后在酶标仪450 nm下读数。结果:按照新药临床前药代动力学中方法学确认的要求进行验证,获得了检测重组抗CD20单克隆抗体的高灵敏度和稳定的ELISA方法。结论:该ELISA方法简便、稳定、灵敏度高,可用于重组抗CD20单克隆抗体的检测。     

抗体偶联小分子药物T-DM1的ELISA检测方法的建立

目的:建立一种灵敏、特异、快速的ELISA方法,用于检测猕猴血清中T-DM1的含量。方法:采用双抗夹心ELISA法对T-DM1进行定量。以DM1单抗作为一抗包被到96孔板中,加入待检样品,之后再加入稀释好的猴血清吸附的羊抗人IgG-HRP(二抗),使之与结合到一抗上的T-DM1特异性结合,加底物显色,在酶标仪上读取D450nm值。结果:建立了检测T-DM1的ELISA方法并得到确证,方法的线性范围为0.625~80 ng/mL,定量下限为0.625 ng/mL,板内及板间精密度和准确度均在±15%以内,室温、冻融、稀释效应稳定性良好。结论:方法学验证表明ELISA法测定猴血清中T-DM1浓度的特异性、精密度和准确度均满足新生物制药临床前药代动力学研究指导原则要求,可用于T-DM1的检测。     

检测重组人鼠嵌合抗VEGFR2单克隆抗体的ELISA方法的建立

目的:建立一种新型、快速定量检测食蟹猴血清中抗血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)单克隆抗体浓度的方法。方法:将特异性抗原VEGFR2-His包被在固相载体上,加稀释的受试药品血清,然后加入HRP标记的羊抗人IgG-(h+1),再加入TMB显色液,最后加入1 mol/L硫酸终止液,在酶标仪上用双波长读取D_(450/560nm)值。结果:建立了定量检测食蟹猴血清中抗VEGFR2单克隆抗体浓度的ELISA法,方法的线性范围为400~6.25 ng/m L,定量下限为6.25ng/m L,板内精密度介于-13.6%~8.3%,板间精密度介于-6.1%~6.3%,与Avastin、Actemra、Cetuximab均无交叉,室温稳定性及冻融稳定性良好,无稀释效应。结论:通过方法学的确证,本实验建立的方法可满足抗VEGFR2单克隆抗体在食蟹猴体内的药代动力学研究要求,可用于抗VEGFR2单克隆抗体的检测。     

基于抗CD20单克隆抗体的2种夹心ELISA法的建立

目的:建立和比较2种灵敏、特异的夹心ELISA方法,用于准确定量检测食蟹猴血浆中重组抗CD20人源化单克隆抗体(rh-anti-CD20zumab)浓度。方法:以rh-anti-CD20zumab为基础,分别用山羊抗人IgG F(ab')2抗体和驴抗人IgG Fc抗体包被96孔酶标板,加入待测样品,均采用HRP标记的猴血清吸附的山羊抗人IgG抗体进行检测,加底物显色,读取D450nm值。结果:建立了2种定量检测rh-anti-CD20zumab的夹心ELISA方法并进行了确证,样品的前处理分别为1∶20和1∶10,方法的线性范围分别为40~5000和40~12 500 ng/mL,定量下限均为40 ng/mL,两者的板内、板间精密度分别小于16.2%和19.4%,准确度分别为-10.3%~16.6%和-14.4%~12.9%。2种方法均具有良好的特异性和稀释线性,且都未出现钩状效应。结论:方法学确证表明,本研究建立的2种ELISA法均符合新生物制品临床前药代动力学研究指导原则的要求,可用于rh-anti-CD20zumab的检测,为后续rh-anti-CD20zumab在食蟹猴体内的药代动力学研究提供了不同的检测方法。     

定量检测重组抗白介素6受体人源化单克隆抗体HS628的ELISA方法的建立及确证

目的:建立一种灵敏、特异、快速、经济的ELISA方法,用于检测食蟹猴血清中重组抗白介素6受体人源化单克隆抗体HS628的含量。方法:对ELISA与生物素-亲和素ELISA(BA-ELISA)方法进行比较,最终采用BA-ELISA法对HS628进行定量。包被抗体为羊抗人Ig G单抗,以生物素标记的重组白介素6受体作为检测抗原,以HRP标记的链霉亲和素作为放大剂,最终用单组分显色液(TMB)显色。结果:建立了特异性检测HS628的ELISA方法并完成方法学确证,该方法的线性范围为1.64~400 ng/m L,灵敏度为1.64 ng/m L,精密度、准确度、回收率及稳定性符合要求,与对照品校正标准曲线吻合。结论:用建立的ELISA方法测定猴血清中HS628的含量能满足新生物制药临床前药代动力学研究指导原则要求,可用于HS628的检测。     

帕妥珠单抗在食蟹猴体内的药代动力学检测方法

目的:建立一种灵敏度高、特异性好且快速的ELISA方法,用以检测食蟹猴体内的帕妥珠单抗含量。方法:采用双抗夹心的ELISA方法对帕妥珠单抗进行定量。以Erb B2单抗作为一抗,将其包被至96孔板上,加入待检样品,之后加入稀释好的二抗(猴血清吸附的羊抗人Ig G-HRP),令结合到一抗上的帕妥珠单抗与其特异性结合,再加入底物进行显色,在酶标仪上用双波长读取D450/560nm值。结果:建立了室温稳定性、冻融稳定性、稀释效应稳定性良好的检测帕妥珠单抗的ELISA方法并得到确证,其定量下限为0.78 nm/m L,线性范围为0.78~50 nm/m L,板间及板内的准确度、精密度均在±15%之内。结论:该ELISA方法学的确证表明用该方法测定帕妥珠单抗浓度具有特异性好、灵敏度高、速度快的特点,能够满足新生物制药临床前药代动力学的指导要求,可应用于帕妥珠单抗的检测。     

检测HSA—GLP-1融合蛋白双抗体夹心ELISA方法的建立

目的：为检测血清中HSA-GLP-1融合蛋白整体分子的浓度,建立一种特异、灵敏的定量检测食蟹猴体内HSA-GLP-1融合蛋白浓度的双抗体夹心ELISA的方法。方法：采用双抗体夹心ELISA方法,以GLP-1单克隆抗体为包被抗体、HSA-GLP-1融合蛋白为夹心抗原、anti-HSA-Biotin为检测抗体,用Streptavidin-HRP进行免疫放大,TMB显色。结果：建立了检测HSA-GLP-1融合蛋白的ELISA方法,其线性范围为15.6~1000 ng/mL,最低检测限为15.6 ng/mL,与GLP-1、HSA、IL2-HSA均无交叉反应,板内和板间精密度均小于15%,准确度为±15%,冻融稳定性和稀释稳定性良好。结论：建立的HSA-GLP-1蛋白检测方法符合新生物制品临床前药代动力学研究指导原则要求,可用于HSA-GLP-1融合蛋白在临床前药代动力学试验的定量检测。     

聚乙二醇重组人促红细胞生成素在食蟹猴体内的药代动力学检测方法

目的:建立2种灵敏度高、特异性好且快速的ELISA方法,用以检测食蟹猴血浆中的聚乙二醇重组人促细胞生成素(EPO)含量。方法:建立了2套双抗夹心的ELISA方法对聚乙二醇重组人EPO进行定量,包括PEG特异性ELISA(检测完整药物)及EPO特异性ELISA(检测总EPO)。完整药物检测:包被小鼠抗重组人EPO单抗,加入稀释的血浆样品,之后加入稀释的生物素标记的兔抗PEG单抗(检测抗体)及链亲和素-HRP(酶标抗体),再加入TMB底物显色,2 mol/L硫酸终止,在酶标仪上用双波长读取D_(450/600nm)值。总EPO检测:包被小鼠抗重组人EPO单抗,加入稀释的血浆样品,之后加入稀释的兔抗重组人EPO多抗-HRP(酶标抗体),再加入TMB底物显色,2 mol/L硫酸终止,在酶标仪上用双波长读取D_(450/600nm)值。结果:建立并验证了2套ELISA方法,定量范围均为4~54 ng/mL,定量下限均为4 ng/mL,准确度和精密度(板内和板间)均在±15%之内(总EPO检测时以聚乙二醇重组人EPO为标准品),同时室温稳定性、冻融稳定性、长期稳定性及稀释线性(空白猴血浆稀释)均良好。结论:方法学确证表明,2套ELISA方法具有良好的灵敏度、准确度、特异性和可重复性,可用于定量测定食蟹猴血浆中聚乙二醇重组人EPO的浓度。     

抗Dysbindin-1多肽双抗夹心ELISA的建立及在肝癌中的应用

目的:制备抗人Dysbindin-1特异性单克隆抗体,建立DAS-ELISA检测体系,并初步应用于肝癌血清的检测。方法:采用合成免疫原免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术制备抗Dysbindin-1单克隆抗体,用HRP标记单克隆抗体,ELISA和SDS-PAGE电泳法检测抗体的亚类、滴度;采用DAS-ELISA技术制备Dysbindin-1检测试剂盒,检测正常、肝硬化及肝癌患者各30例血清并比较其差异。结果:细胞融合后获得了4株稳定产生抗Dysbindin-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株(1C6A11、1E8H3、2D1C11、5B6D4),抗体亚类分别为IgG2b,IgG2b,IgG1和IgG2a,杂交瘤细胞诱生的腹水抗体效价达106以上,通过抗体配对实验筛选确定2D1C11作为包被抗体,1E8H3作为酶标抗体。该ELISA方法线性范围为62.5-1000ng/mL,检测限为62.5ng/mL;应用该方法检测显示正常组与肝硬化组及肝癌组间差异显著(P0.001),Dysbindin-1诊断肝癌的敏感性和特异性分别为90%和93.3%。结论:Dysbindin-1可以成为新的候选的肝癌血清标志物,抗Dysbindin-1多肽双抗夹心ELISA体系可以初步应用于肝癌的早期诊断。     

重组人鼠嵌合抗CD20单克隆抗体免疫原性检测方法的建立

目的:建立一种灵敏、特异、操作简单的ELISA方法,用于检测食蟹猴血清中抗CD20单克隆抗体的免疫原性。方法:首先采用桥连ELISA法对抗药物抗体(ADA)进行定性筛选,以抗CD20单克隆抗体作为包被抗体,以生物素标记的抗CD20单克隆抗体作为检测抗体,二者共同结合血清中存在的ADA,以D450/560nm值超过临界值作为阳性判断标准;初筛为阳性的样本采用免疫清除法进一步确证,并同时进行免疫交叉试验考察ADA对供试品和原研对照品的免疫反应有无差异。结果:建立了检测ADA的筛选方法和确证方法,确定了检测的临界值和归一化因子,血清中抗药物抗体的检测灵敏度达3.5 ng/m L,批内/批间精密度介于3.1%~7.4%,准确度介于-1.2%~9.5%;食蟹猴连续给药后,部分个体产生特异性抗体,且抗体滴度随时间延长而增高。结论:建立的ADA筛选方法和确证方法可用于毒性试验的免疫原性检测;动物给药剂量对抗体的产生有较大影响,低剂量连续给药更易诱发特异性抗体产生。     

抗嗜肺军团菌血清8型单克隆抗体的制备及双抗体夹心酶联免疫吸附试验检测法的建立

目的：制备针对嗜肺军团茵血清8型的单克隆抗体,并建立双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）检测方法。方法：用甲醛灭活的嗜肺军团菌血清8型菌免疫BALB／c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗嗜肺军团菌血清8型单克隆抗体,建立双抗夹心ELISA检测方法。结果：研制出8株能特异性分泌抗嗜肺军团菌血清8型单克隆抗体的杂交瘤细胞株,Ig类型分别为IgM（2株）、IgG,（1株）和IgG,（5株）;利用IgG1型单抗6G10与6C7配对,建立了双抗夹心ELISA检测方法,该方法的最低检出浓度为2．6×10^5cfu／mL,除与金黄色葡萄球菌有微弱的交叉反应外,与14株其他血清型嗜肺军团菌、17株非嗜肺军团菌及11株非军团菌均无交叉反应,具有较高的特异性。结论：制备了具有高特异性和亲和力的抗嗜肺军团菌血清8型单克隆抗体,并建立了双抗夹心EUSA检测方法。     

检测恒河猴血清中trastuzumab浓度的一种直接酶联免疫竞争法

采用ELISA法建立检测恒河猴血清中trastuzumab的酶联免疫竞争法,为研究人体内trastuzumab的药物动力学学和药效学提供依据。方法的测量范围是1～100μg／mL,最低检测限为1．0μg／mL。板内精密度范围91％～107％,相对标准偏差为1．5％～4．9％。板间精密度范围102％～110％,相对标准偏差为2．7％～15．4％。方法中未显示与重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白、重组抗CD20单克隆抗体、丙种球蛋白等的交叉反应。此方法的特异性、灵敏度、精密度和准确度均满足恒河猴血清样品的分析,是检测猴和人体内trastuzumab的理想方法。     

抗HLJ1单克隆抗体的制备及抗原检测方法的建立

为制备抗人肝脏DnaJ-like蛋白(Human liver DnaJ-like protein, HLJ1)的单克隆抗体, 并建立免疫组化和双抗体夹心ELISA检测HLJ1的方法。采用淋巴细胞杂交瘤技术, 获得两株能稳定分泌抗HLJ1单克隆抗体的杂交瘤细胞株A4C7和 C4C8。经鉴定, 两株单抗的亚类均为IgG1, 并且效价高、特异性好。以单抗A4C7和C4C8作为一抗, 对人胎肝组织石蜡切片进行免疫组化染色, 结果表明, 两株单抗均为阳性染色, 且HLJ1主要定位于胎肝细胞的胞浆。选取A4C7进行HRP酶标记, 并以HRP- A4C7作为酶标抗体, 以C4C8作为包被抗体, 建立双抗体夹心ELISA方法, 并进行棋盘滴定确定抗体的最佳工作浓度。该检测方法的线性范围是15~750 ng/mL, 灵敏度下限达15 ng/mL, 特异性良好。所建立的免疫组化和双抗体夹心ELISA 法可用于快速、灵敏地检测组织及血清中的HLJ1蛋白, 为HLJ1的肿瘤相关性研究提供了有力的工具。     

玉米赤霉烯酮单克隆抗体的制备及间接竞争ELISA检测方法的建立

玉米赤霉烯酮具有较强的生物毒性,检测谷物中的玉米赤霉烯酮在食品和饲料安全中具有重要的作用.将玉米赤霉烯酮与牛血清白蛋白的偶联物免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体,并建立基于单克隆抗体的酶联免疫法作为检测玉米赤霉烯酮的方法.结果共筛选到4株抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体,3株抗体亚类为IgG1,1株为IgG2b.选择其中的一株杂交瘤细胞2C9制备小鼠腹水,纯化后测定了抗体效价为1/40 000.以此单抗建立的间接竞争ELISA方法,其半数抑制率(IC50)为1.90 ng/mL,检测限(IC10)为0.051 ng/mL,检测区间(IC20-IC80)为0.115-13.900 ng/mL;且对玉米赤霉烯酮有很好的特异性.回收率检测在样品含1.46-93.80 μg/kg时回收率为96.5％-113.0％.本实验建立的检测方法可用于多种谷物及饲料样本中玉米赤霉烯酮的检测.     

hGH单克隆抗体的筛选及双抗体夹心ELISA检测方法的建立

采用杂交瘤法制备单克隆抗体,并用辛酸-硫酸铵法纯化单抗,通过ELISA方法和Western blotting测定抗体的效价与特异性,并进行抗体类型、相对亲和力测定;应用纯化的单抗建立hGH双抗体夹心ELISA检测方法。筛选出两株可以稳定分泌抗hGH单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为3E11、2G9,抗体类型均为IgG1,抗体滴度均可达10-10,特异性好,相对亲和力高,以筛选到的两株单抗建立的双抗夹心ELISA法线性范围为0.09～1.5625ng/mL,R2>0.9,灵敏度为0.09ng/mL。筛选出高效抗hGH的单抗,并建立了hGH双抗体夹心ELISA检测方法。     

多肽抗体检测原发性肝癌血清标志物ELISA方法的建立及应用

血清多肽是癌症诊断信息的重要来源,建立、优化了检测多肽标志物的直接ELISA法,并应用于肝癌血清中的多肽标志物的检测。制备及纯化针对多肽标志物Pep5的单克隆抗体并进行辣根过氧化物酶标记,用其建立检测相应抗原的直接ELISA法。方法线性范围为1.5-20 ng/mL,检测限为1.24 ng/mL;标准品批内及批间CV分别小于3.66%及4.89%,血清样本批内及批间CV分别小于11.69%及18.18%;线性范围内(9、12和15 ng/mL)的回收率分别为98.98%,99.61%和101.58%。应用该方法共检测160例正常血清、104例肝硬化及156例肝癌患者血清,正常组与肝硬化组及肝癌组间差异显著(P<0.001),Pep5诊断肝癌的敏感性和特异性分别为80.8%和96.2%。同时检测94例HCC血清中的AFP和Pep5,AFP检出率为63.8%,Pep5检出率为90.4%,AFP联合Pep5检测时,能将HCC的检出率提高至94.7%。     

定量检测猕猴血清中重组人源化抗狂犬病毒单克隆抗体间接ELISA法的建立

目的：建立定量检测血清中重组人源化抗狂犬病毒单克隆抗体（HuMabs）NM57的间接ELISA法,为药代动力学研究提供一种简单快速的方法。方法：采用狂犬病毒糖蛋白包被酶标板、HRP标记的IgG-Fc段为标记抗体,建立定量检测HuMabsNM57的间接ELISA法,并对其特异性、灵敏度、精密度及准确度进行检测。结果：间接ELISA法检测HuMabsNM57的灵敏度为5ng／mL,组内及组间精密度分别为2．6％-6．0％、8．5％-11．3％。结论：建立了灵敏度高、特异性强的检测HuMabs NM57的间接ELISA法,精密度及准确度均符合药代动力学要求,可用于猕猴及人血清中HuMabsNM57的检测。     

建兰花叶病毒单克隆抗体的制备及检测应用

用建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)免疫的BALB/C鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选克隆,获得3株能稳定传代并分泌抗CymMV单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞(2C6、5B7和12G9),分别制备它们的单抗腹水。其中5B7和12G92株单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10-6,3株单抗的抗体类型及亚类均为IgG1,轻链均为κ链。利用单克隆抗体建立了抗原包被间接ELISA(ACP-ELISA)检测CymMV的方法。蝴蝶兰病叶作1∶10240倍稀释、提纯CymMV病毒浓度为4.87ng/mL(每孔的病毒绝对量为0.487ng)时,该方法仍能检测到病毒。利用ACP-ELISA方法检测了田间样品,发现CymMV在兰花上发病很普遍。     

双抗体夹心ELISA检测HIV-1 gp41抗原方法的建立

目的:建立检测HIV-1gp41抗原的双抗体夹心ELISA,并探讨其临床应用的可行性。方法:用饱和硫酸铵(SAS)纯化抗HIV-1gp41-5单克隆抗体(mAb),用HRP标记后建立双抗体夹心ELISA法,对其灵敏度及特异性进行检测,并用该方法对40份HIV-1阳性血清进行了检测。结果:用mAbE12(5μg/mL)为包被抗体,2H6为酶标记抗体(1∶900)建立了双抗体夹心ELISA法,检测gp41-5多肽的灵敏度是100pg/mL。对HIV-1阳性血清中gp41抗原的检出率为67.5%(27/40)。结论:建立了特异性强、灵敏度良好的检测HIV-1gp41抗原的双抗体夹心ELISA法。