鸭源鸡杆菌ompW、gtxA双基因缺失株的构建及其相关特性分析

鸭源鸡杆菌(Gallibacterium anatis,G.anatis)是家禽中常见的条件性致病菌,主要引起蛋鸡生殖道疾病,造成产蛋量下降。【目的】为探究RTX样毒素GtxA及外膜蛋白(OmpW)对鸭源鸡杆菌生物学特性和致病力的影响。【方法】本研究采用自然转化法对突变株RZ△ompW进一步缺失gtxA构建突变株RZ△ompW△gtxA,通过分析其生长特性、黏附能力、引起细胞凋亡程度及对小鼠致病性等,探究其与生物学特性及致病性可能的关系。【结果】结果显示,RZ△ompW△gtxA能稳定遗传gtxA的缺失;单双基因突变株溶血活性均消失、与RZ株相比菌落形态及生长速率并未出现显著改变;相比RZ、RZ△ompW和RZ△gtxA,双基因缺失株RZ△ompW△gtxA在不同时段对鸡原代输卵管上皮细胞的黏附能力显著降低(P0.05),诱导鸡输卵管上皮原代细胞发生凋亡的能力明显减弱,对小鼠的致病力显著降低。【结论】GtxA毒素和外膜蛋白OmpW在鸭源鸡杆菌毒力、黏附宿主细胞及诱导其细胞凋亡中起重要作用,且可能存在明显的协同关系。本研究为鸭源鸡杆菌感染机制的阐明奠定基础。     

河南省及周边省份猪群中大面积感染猪伪狂犬病毒的病因分析

2011年初开始,猪伪狂犬病(pseudorabies,PR)在河南省及周边省份再次突然出现严重暴发。为查明原因,应用PRV gE抗体ELISA检测试剂盒对2011年1月至2013年5月送检的16 800份猪血清、905份猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)"返饲"病料和56份PR基因缺失活疫苗分别进行野毒感染检测,通过PCR方法对11株PRV新流行毒株的TK、gE基因进行序列测定与分子特征分析,同时对这些毒株的毒价测定、免疫攻毒保护试验以及疫苗效价测定等开展研究。结果显示,PRV野毒感染阳性猪场检出率高达68.06%,血清总阳性率为38.47%,种母猪、种公猪、后备猪和商品猪的阳性率分别为40.12%、30.88%、54.67%和26.52%;新流行毒株聚在同一进化分支,均属于强毒株,但毒力较经典毒株变化不大,gE基因长度均为1 787bp,TK基因长度均为963bp,与不同年代中国参考毒株的核苷酸、氨基酸序列同源性分别为98.2%~99.8%、97.1%~99.8%和98.9%~99.6%和97.5%~99.4%;商品疫苗对新流行毒株的保护率为100%;疫苗和"返饲"病料中,PRV野毒阳性检出率分别为0%和40.44%。研究结果证实,2011年后河南省及周边省份猪群中,PRV野毒感染率大幅攀升;PRV新流行毒株的主要毒力基因并未发生明显变异;疫苗中未存在PRV野毒污染,而且可完全抵抗新流行毒株的攻击;种公猪、后备猪普遍带毒和PEDV"返饲"病料中严重污染野毒是造成2011~2013年间河南省及周边省份猪群中PRV大面积感染和疫情暴发的主要因素。     

我国首株猪盖他病毒的分离与鉴定

盖他病毒(Getah virus,GETV)是一种广泛分布于欧亚大陆及澳大利亚北部太平洋沿岸的人兽共患虫媒病毒,我国目前各地仅从蚊子中分离到该病毒。本研究在对一猪场疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)流产胎儿进行多重RT-PCR检测时,由检测猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)的一对引物扩增出一非特异性条带,测序及在NCBI数据库中BLAST结果显示,该序列与GETV序列高度相似。经病毒分离、传代、蚀斑纯化,获得一株能够在Marc-145细胞上稳定生长的分离物。电镜观察显示,该病毒有囊膜及纤突,直径约70 nm,接近于球形,具有披膜病毒科甲病毒属成员的典型形态特征,将该分离物命名为HNJZ-S1株盖塔病毒(Getahvirus)。全基因序列分析结果显示,分离物HNJZ-S1基因组全长11 689 bp,与GenBank中现有14株GETV序列相似性为97.4%～99.3%,其与韩国猪源毒株AY702913(登录号AY702913)序列相似性最高(99.3%)。遗传进化分析显示,HNJZ-S1与日本蚊源毒株12IH26、马源毒株14-I-605-C1、14-I-605-C2及中国蚊源毒株HB0234亲缘关系最近,处于同一进化分支。其E2基因推导的氨基酸序列分析结果显示,HNJZ-S1与韩国猪源毒株AY702913和QIAG9302以及日本马源毒株14-I-605-C1、14-I-605-C2和中国蚊源毒株HB0234等处于同一进化分支。本研究首次从我国发病猪群中检测并分离到GETV,也是迄今为止中国唯一一株来自脊椎动物的盖他病毒,对猪源GETV的感染谱和致病性、感染和传播机制、环境微生物学及公共卫生等相关研究具有重要意义,并为之提供了宝贵的研究素材。     

鸡传染性法氏囊病毒实时qRT-PCR检测方法的建立及初步应用

根据高效培养鸡传染性法氏囊病毒（IBDV）时对病毒滴度检测的需要,本文针对BDV的VP4基因的保守序列设计并合成了一对引物,以所构建的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测IBDV核酸载量的SYBR Green I荧光定量实时RT-PCR(qRT-PCR)方法,结果表明,其Ct值与标准品模板在4.03×1E1～1E9 拷贝/μL范围内呈良好的线性关系,对IBDV核酸的最低检出量为40拷贝/μL,灵敏度是常规RT-PCR检测方法的1000倍;该方法不与其它禽源病毒发生交叉反应,批内变异系数小于0.05%。应用本方法对DF-1细胞中IBDV的增殖滴度进行了测定,并与经典的TCID50测定方法进行了比较。结果显示两种方法测定的IBDV在微载体悬浮培养和方瓶静态培养条件下DF-1细胞上的增殖曲线都具有一定的平行关系,且qRT-PCR方法比TCID50方法更加快速和敏感,更适合于对IBDV增殖滴度的实时快速测定。     

禽支气管炎病毒Jin-13分离株在SPF鸡体内的动态分布

本研究旨在掌握禽传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)感染SPF鸡后在体内的动态分布。针对IBV流行毒Jin-13株N基因设计并合成一对引物,建立了检测IBV Sybr green I荧光定量PCR方法。人工感染90日龄SPF鸡1、4、7、10、14、21、28和35d后检测心脏、肝脏、脾脏、肺脏、气管、肾脏和十二指肠等内脏器官病毒载量,以研究体内病毒复制动态及分布情况。该方法在7.77×108~100拷贝/μL范围内具有良好的线性关系,可检测到初始模板中7.7拷贝/μL的病毒核酸,比常规RT-PCR方法敏感100倍。结果表明鸡群从感染后第4日开始发病,各组织器官内IBV病毒含量逐渐升高,至第7日肾脏病毒含量最高达到7.13×104拷贝/μL,其余依次为气管、肺脏、脾脏、心脏、肝脏和十二指肠。攻毒10日后各组织内含量均逐渐降低。肝脏于攻毒后21日时已检测不到IBV。于攻毒后第28日肾脏、气管和肺脏仍能检测到IBV。心脏可持续带毒35d。本研究从组织嗜性和动态分布方面为解释了IBV Jin-13株感染后的持续排毒及其严重的致肾损伤现象。     

中国4省猪场猪盖他病毒感染调查及病原分离鉴定

为了解我国猪盖他病毒(Getah virus,GETV)流行情况,本研究利用RT-PCR和病原分离方法在国内首次对晋、冀、豫、皖4省231个猪场的801份猪脏器和组织进行GETV的病原学调查及部分基因序列分析。试验结果显示,从4省的猪群样品中均检出GETV,其中从231个猪场中32个阳性养殖场的病料中检出37份阳性样品,猪场阳性率为13.9%,样品阳性率为4.62%,并首次从种公猪精液中检出GETV。对该病毒Cap和NSP3基因扩增产物的进行序列分析,发现目前中国猪群中的GETV与日本近年猪源、马源及蚊源毒株亲缘关系最近,其次中国近年蚊源和韩国猪源毒株;遗传进化分析显示49个已知序列的GETV可分为3个群或谱系,其中75.5%的毒株属于2000年以后报道的Ⅲ群,具有明显的地域和年代特征且未发现物种特征。从样品中分离出两株GETV HNNY-1和HNJZ-S2,其全基因组均为11 689bp,且与Cap和NSP3基因序列分析结果基本一致,均与2012年以来的所有日本毒株亲缘关系最近。本研究首次揭示在我国4省份猪群中均有GETV存在且种公猪也可带毒,应引起人们重视。鉴于国内外目前均把该病毒看作是人兽共患病病原,因此有必要对其在中国猪群中的感染谱、传播途径、流行规律、致病性及防控措施等进行深人研究,为实时了解其在人畜间的感染和流行情况、制定有效防控措施提供科学依据。     

地方土猪脑心肌炎病毒的分离、鉴定及全基因组序列分析

脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)是一种自然疫源性人兽共患病病原,但有关地方土猪EMCV的分离、鉴定及全基因组研究等尚未见报道。本研究应用"细胞接种与RT-PCR方法相结合"技术,成功分离到国内首株淮南猪源EMCV,命名为HNXX13株,并对其进行了系统鉴定和全基因组序列测定分析。结果显示,该病毒粒子大小约为24~30nm,呈圆形,不耐酸和热,对胰蛋白酶敏感,对氯仿不敏感,二价阳离子没有保护作用,所感染BHK-21细胞的细胞浆内可见到特异的绿色荧光;基因组全长为7 725bp(GenBank登录号:KF771002),与不同动物源参考毒株的核苷酸同源性为81.0%~99.9%,与国内猪源参考毒株同源性为99.5%以上;基于全基因组序列和ORF的系统发育进化树显示,EMCV可分为G1、G2和G3 3个群,HNXX13株与国内其他参考毒株同属于G1群。研究结果表明,地方土猪可感染EMCV并引起发病,丰富了我国EMCV分子流行病学资料,并提醒在进行地方品种养殖中要充分考虑人兽共患疫病传播的生态学;EMCV存在较大的地域差异,其传播具有一定的区域限制性;EMCV在地方土猪和鼠之间可能存在着交叉感染与传播;EMCV在感染地方土猪时可能会发生个别氨基酸的突变,以适应不同的猪种。     

两株田间重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定、进化分析及其致病性研究

为了解2型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV2)田间毒株重组特征,本研究对两株分离物(HENXX-8、HENJY-2)进行全基因测序、进化分析及毒力测定,并对其全基因序列进行重组分析。结果显示,两个毒株均属于PRRSV 2,两者与其代表株VR-2332的核苷酸相似性分别为85.6%、85.7%;与高致病性PRRSV(HPPRRSV)毒株JXA1、TJ和WUH4株分别为85.7%～85.8%、85.4%～85.5%;与经典毒株CH-1a、HB-2(sh)分别为84.7%～85.7%、84.5%～85.7%;而与所有NADC30类毒株均在90.0%以上。全基因、ORF5及Nsp2序列进化分析结果均显示两个分离物与国内报道的类NADC30毒株遗传距离较近,同处于一个分支。全基因组重组分析结果表明,两个分离毒株存在明显重组现象,且重组模式均以类NADC30毒株为骨架病毒,与HP-PRRSV毒株发生重组。但重组对象不同:HENJY-2是由类NADC30毒株与TJ株发生重组;而HENXX-8则是由类NADC30毒株与WUH4、TJ株发生3毒株间重组。由于重组部位序列缺乏特异性分子标志,因此无法确定与类NADC30发生重组的是HP-PRRSV还是其减毒的疫苗毒株。两株分离物的重组部位与早期分离毒株HENANHEPB、JL580等有所不同,均未涉及到ORF5基因,而是集中在Nsp1～Nsp2以及ORF2a～ORF3区域,主要发生在病毒基因组的靠5'端(30～7 000 bp)和3'端(11 000～13 000 bp)处。对部分重要基因的核苷酸相似性分析结果显示,两个分离株的ORF2a、ORF3基因与HP-PRRSV毒株相似性最高,表明重组病毒的这两个基因可能来自HPPRRSV毒株。致病性试验结果表明,参考毒株HENXC-4的毒力略高于分离毒株HENXX-8,主要表现在体温升高、日均增重降低和肺部病变上。但两个分离物均未引起发病猪死亡。以上结果表明,目前PRRSV2在田间的基因重组事件存在随机性,提示不同毒株在田间的存在会加剧PRRSV重组事件的发生和流行、毒株类型更加复杂,从而增加了临床防控难度。因此,慎重使用活疫苗并持续监测活疫苗毒株在田间的变异动态,对更好防控本病具有一定的临床指导意义。