博落回果实药材质量标准研究

目的:制定博落回果实药材质量标准,为该药用植物资源的开发利用提供科学依据.方法:生药学研究,理化鉴别,醇浸出物测定法,紫外/可见分光光度法,薄层色谱法及HPLC色谱法.结果:对博落回果实的性状、显微特征进行了描述;对6个不同产地及收集时间博落回果实的醇浸出物进行了测定;同时对其活性成分血根碱和白屈菜红碱进行了薄层定性鉴别和HPLC定量研究.结论:通过研究制定了博落回果实的质量控制标准.     

鸭源鸡杆菌ompW、gtxA双基因缺失株的构建及其相关特性分析

鸭源鸡杆菌(Gallibacterium anatis,G.anatis)是家禽中常见的条件性致病菌,主要引起蛋鸡生殖道疾病,造成产蛋量下降。【目的】为探究RTX样毒素GtxA及外膜蛋白(OmpW)对鸭源鸡杆菌生物学特性和致病力的影响。【方法】本研究采用自然转化法对突变株RZ△ompW进一步缺失gtxA构建突变株RZ△ompW△gtxA,通过分析其生长特性、黏附能力、引起细胞凋亡程度及对小鼠致病性等,探究其与生物学特性及致病性可能的关系。【结果】结果显示,RZ△ompW△gtxA能稳定遗传gtxA的缺失;单双基因突变株溶血活性均消失、与RZ株相比菌落形态及生长速率并未出现显著改变;相比RZ、RZ△ompW和RZ△gtxA,双基因缺失株RZ△ompW△gtxA在不同时段对鸡原代输卵管上皮细胞的黏附能力显著降低(P0.05),诱导鸡输卵管上皮原代细胞发生凋亡的能力明显减弱,对小鼠的致病力显著降低。【结论】GtxA毒素和外膜蛋白OmpW在鸭源鸡杆菌毒力、黏附宿主细胞及诱导其细胞凋亡中起重要作用,且可能存在明显的协同关系。本研究为鸭源鸡杆菌感染机制的阐明奠定基础。     

中国4省猪场猪盖他病毒感染调查及病原分离鉴定

为了解我国猪盖他病毒(Getah virus,GETV)流行情况,本研究利用RT-PCR和病原分离方法在国内首次对晋、冀、豫、皖4省231个猪场的801份猪脏器和组织进行GETV的病原学调查及部分基因序列分析。试验结果显示,从4省的猪群样品中均检出GETV,其中从231个猪场中32个阳性养殖场的病料中检出37份阳性样品,猪场阳性率为13.9%,样品阳性率为4.62%,并首次从种公猪精液中检出GETV。对该病毒Cap和NSP3基因扩增产物的进行序列分析,发现目前中国猪群中的GETV与日本近年猪源、马源及蚊源毒株亲缘关系最近,其次中国近年蚊源和韩国猪源毒株;遗传进化分析显示49个已知序列的GETV可分为3个群或谱系,其中75.5%的毒株属于2000年以后报道的Ⅲ群,具有明显的地域和年代特征且未发现物种特征。从样品中分离出两株GETV HNNY-1和HNJZ-S2,其全基因组均为11 689bp,且与Cap和NSP3基因序列分析结果基本一致,均与2012年以来的所有日本毒株亲缘关系最近。本研究首次揭示在我国4省份猪群中均有GETV存在且种公猪也可带毒,应引起人们重视。鉴于国内外目前均把该病毒看作是人兽共患病病原,因此有必要对其在中国猪群中的感染谱、传播途径、流行规律、致病性及防控措施等进行深人研究,为实时了解其在人畜间的感染和流行情况、制定有效防控措施提供科学依据。     

禽支气管炎病毒Jin-13分离株在SPF鸡体内的动态分布

本研究旨在掌握禽传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)感染SPF鸡后在体内的动态分布。针对IBV流行毒Jin-13株N基因设计并合成一对引物,建立了检测IBV Sybr green I荧光定量PCR方法。人工感染90日龄SPF鸡1、4、7、10、14、21、28和35d后检测心脏、肝脏、脾脏、肺脏、气管、肾脏和十二指肠等内脏器官病毒载量,以研究体内病毒复制动态及分布情况。该方法在7.77×108~100拷贝/μL范围内具有良好的线性关系,可检测到初始模板中7.7拷贝/μL的病毒核酸,比常规RT-PCR方法敏感100倍。结果表明鸡群从感染后第4日开始发病,各组织器官内IBV病毒含量逐渐升高,至第7日肾脏病毒含量最高达到7.13×104拷贝/μL,其余依次为气管、肺脏、脾脏、心脏、肝脏和十二指肠。攻毒10日后各组织内含量均逐渐降低。肝脏于攻毒后21日时已检测不到IBV。于攻毒后第28日肾脏、气管和肺脏仍能检测到IBV。心脏可持续带毒35d。本研究从组织嗜性和动态分布方面为解释了IBV Jin-13株感染后的持续排毒及其严重的致肾损伤现象。     

猪源肠道乳酸菌的分离与生物学特性研究

目的分离猪消化道中的乳酸菌。方法无菌采集健康猪的新鲜粪便,接种MRS培养基,厌氧培养分离乳酸菌。并对分离菌形态学,生化特性,产酸性,耐酸性,耐胆汁性,高温耐受性,抑菌性等方面进行研究。结果分离到5株嗜酸乳杆菌,分离的细菌对2株致病菌明显具有抑制性。结论为研制高效专一的猪用微生态制剂奠定基础。     

郑州部分市售酸奶中乳酸菌的分离鉴定与益生特性的研究

目的调查郑州部分市售的酸奶中嗜热乳酸链球菌与保加利亚乳酸杆菌存在情况与益生特性。方法无菌采取样品进行乳酸菌分离,并对分离菌进行形态学、生化特性、产酸性、耐酸性、耐胆汁性、高温耐受性和抑菌性等生物学特性研究。结果从8种品牌中分离到4株保加利亚乳酸杆菌、7株嗜热链球菌,且分离菌株均能产酸、对高温具有一定的耐受性,在pH 3.0以上均能生长良好,而且分离菌的抑菌物质具有一定的热稳定性,保加利亚乳酸杆菌经70、100℃热处理抑菌活性基本不变。嗜热链球菌经70℃热处理后保留90%以上的抑菌活性,但经100℃高温处理后抑菌活性有所降低。分离菌产生的抑菌物质对胰蛋白酶敏感,保加利亚乳酸杆菌在偏中性条件下抑菌活性较高,而嗜热链球菌在偏中性条件下丧失抑菌活性。结论本研究为河南市售酸奶质量以及为消费者提供有利信息奠定基础。     

一种改进的异硫氰酸胍法结合硅胶膜离心吸附柱提取孕妇外周血微量胎儿RNA的方法

孕妇外周血中存在胎儿RNA为无创性产前诊断提供了基础.但血液中富含RNA酶和微量胎儿RNA的特点,对从孕妇血浆中提取胎儿RNA带来困难. 我们以ε血红蛋白基因和胎盘特异表达基因4（PLAC4）mRNA作为研究对象,用改进的异硫氰酸胍法结合硅胶膜离心吸附柱法探索孕妇外周血中胎儿微量RNA的提取方法,获得满意效果. 30例孕妇和9例非孕妇外周血样品中总RNA经凝胶电泳测定显示3条带,分别为28S, 18S和 5.8S. 其28S条带亮度为18S亮度的2倍.总RNA质量浓度（A260／A280）为1.97 g/L,光密度比值(A260-A320）/（A280- A 320）为1.86. 30例孕妇外周血样本有7例提取到ε血红蛋白基因mRNA,ε血红蛋白基因 mRNA 的最小浓度为0.537 μg/mL,最大浓度为1.79 μg/mL,ε血红蛋白基因mRNA的浓度中位数为124 μg/mL. 30例孕妇外周血样本提取到PLAC4 基因mRNA,浓度最小值为2.105×103 copies/mL,最大值为12.760×103 copies/mL,而9例非孕妇中均未提取到（P＜0.01）,浓度中位数为6.612×103 copies/mL. 因此,改进的异硫氰酸胍法与硅胶膜离心吸附柱纯化法相结合,可有效抑制RNA降解,用于提取、纯化孕妇血液中微量胎儿RNA.     

猪流行性腹泻病毒nsp1蛋白对Ⅰ型干扰素应答的影响

猪流行性腹泻病毒 (PEDV) 能抑制宿主Ⅰ型干扰素及其诱导的细胞抗病毒免疫应答,但是PEDV抑制Ⅰ型干扰素应答的分子机制尚不明了,尤其是PEDV非结构蛋白 (Nonstructural proteins,nsps) 在Ⅰ型干扰素应答中的调控作用研究不多。为研究PEDV非结构蛋白1 (nsp1) 对细胞Ⅰ型干扰素应答的影响,构建了真核表达载体pCAGGS-nsp1,采用Western blotting和间接免疫荧光试验确定nsp1在细胞中的表达。通过报告基因法、ELISA以及病毒复制抑制试验评估nsp1对Ⅰ型IFN的影响。结果显示,nsp1在转染细胞和病毒感染细胞中均高效表达;双荧光报告基因试验结果表明,nsp1能显著抑制IFN-β启动子活性,且具有剂量依赖性。ELISA结果显示,nsp1能显著抑制IFN-β蛋白的表达。水泡性口炎病毒 (VSV) 复制抑制试验结果显示,nsp1明显抑制poly(I:C)介导的Ⅰ型IFN的抗病毒作用。结果提示,nsp1作为PEDV的保守蛋白,具有拮抗Ⅰ型干扰素启动子活性和应答的功能,为揭示PEDV逃逸宿主天然免疫应答的机制和研发新型高效抗PEDV疫苗奠定基础。