水产养殖动物遗传连锁图谱及QTL定位研究进展

自1997年美国农业部启动5种水产养殖动物基因组计划以来,在不到10年的时间里,世界各国都相继开展了本国主要水产养殖动物基因组研究。截至2005年底,有近17种海淡水养殖动物公布了遗传连锁图谱：属于高密度连锁图谱的有虹鳟和大西洋鲑（标记数超过1000）;属于中密度遗传连锁图谱的有罗非鱼、沟鲶、黑虎虾、日本牙鲆和欧洲海鲈（标记数为400-1000）;属于低密度遗传连锁图谱的有泰国的胡鲶,中国的栉孔扇贝、鲤鱼,日本的黄尾鲕,美国的牡蛎等近10种养殖种类（标记数少于400）。水产养殖动物遗传连锁图谱的构建和发展,促进了一些与经济性状（如生长、抗逆、发育等）相关的数量性状位点（QTL）的定位研究。然而,QTL定位研究目前只在具有中高密度遗传连锁图谱的鲑科鱼类（虹鳟、大西洋鲑和北极嘉鱼）、罗非鱼、沟鲶和日本牙鲆等种类中开展,而且定位研究仍处在初级水平。遗传连锁图谱的高分辨率和QTL在图谱上的精确定位,是今后能否实现对主要水产养殖动物的经济性状进行遗传操作的技术保证,同时也是实现分子标记或基因辅助育种在水产养殖动物中成功运用的制胜法宝。     

建鲤(Cyprinus carpio var. Jian)微卫星DNA亲权鉴定

利用16个微卫星座位对建鲤10个全同胞家系647个子代进行亲权鉴定。Cervus3.0分析表明,16个微卫星位点的平均多态信息含量为0.7025,平均等位基因数为6.63,期望杂合度平均为0.7405。当双亲未知时,累积排除概率为0.999225,已知单亲时的累积排除概率为0.999996,置信度为95%。进一步模拟分析表明,要达到亲权鉴定的要求在双亲未知时通常需要8～12个微卫星位点,已知单亲时需要5～8个微卫星位点。在双亲均未知的情况下进行亲权鉴定,94.6%的后裔找到了其父母本,真实鉴定率低于模拟分析预测值,分析可能是与候选亲本间存在亲缘关系、无效等位基因的存在以及分型错误等因素有关。9个建鲤全同胞家系的鉴定,为今后的遗传图谱构建、QTL定位及分子标记辅助育种研究奠定了基础。     

虾夷扇贝（Patinopecten yessoensis）5个群体的遗传多样性

虾夷扇贝为20世纪80年代初从日本引入我国并逐渐开展养殖的双壳贝类,目前已在我国北方地区大面积养殖。实验采用微卫星分子遗传标记技术对大连獐子岛底播增殖放流群体（CC）、黄海北部海区采集的野生群体（HQ）、日本青森养殖群体（JX）、俄罗斯远东日本海沿岸养殖群体（RX）及大连大长山岛养殖上壳白化群体（ZB）等5个虾夷扇贝群体的遗传多样性进行研究。其中HQ群体为本课题组2005年在黄海北部采集的野生群体,本研究筛选出一个该群体的特异性遗传标记。用8个微卫星位点进行扩增,共获得45个等位基因,每个位点的等位基因数处于3—9之间,大小为100—340bp,平均有效等位基因数为3．1535,基因型数为3—21个,PIC（PolymorphismInformationContent）值处于0．0322-0．5944之间。5个群体的平均观测杂合度分别为0．3292、0．3048、0．3167、0．2708、0．3042,平均期望杂合度分别为0．4595、0．4002、0．3838、0．3620、0．3885,群体间的多态性差异不显著。根据群体间遗传相似性系数、遗传距离及UPGMA聚类分析发现,CC和HQ群体亲缘关系最近,JX和RX群体的亲缘关系较近,ZB群体与JX和RX群体的亲缘关系较近。通过Hardy—Weinberg平衡及F-检验发现,5个群体都不同程度的偏离平衡,表明各群体基因频率和基因型频率的稳定性较低,且5个群体均处于不同程度的杂合子缺失状态,群体间的遗传分化程度较高,但遗传变异主要来自群体内的个体间。     

基于整合图谱的鲤生长相关性状QTL的分布及变异规律

单个群体数量性状位点(QTL)的检测和识别效率通常是有限的,而多个群体能提高QTL的检测效率并能更好地了解其等位基因的变异和分布.本研究利用4个群体构建了鲤鱼的整合图谱,在此基础上比较分析了不同群体QTL的分布及变异.整合图谱长度为2371.6cM,包含257个微卫星(SSR)和421个SNP标记分布于42个连锁群,平均标记间隔为3.7cM.将4个群体的体重、体长、体高和体厚共67个QTL定位到整合图谱上进行比较分析,发现仅有1个QTL为3个群体共享,9个QTL为2群体共享,未发现4个群体均共享的QTL.QTL的比较分析结果表明,共享QTL可能在控制不同鲤鱼种质间生长性状中起主要作用.此外,探讨了QTL在不同群体间变化的原因和规律,同时揭示了主效和微效基因在不同群体中的遗传表现,为QTL定位策略和分子育种改良鲤生长性状提供理论基础.     

镜鲤(Cyprinus carpio)肌间刺数量微卫星标记筛选与相关性分析

该文从200个微卫星标记中筛选出149个多态性标记,并对镜鲤(Cyprinus carpio)子代个体数最多的家系进行了肌间刺数量的相关性分析。结果表明有8个微卫星标记与肌间刺数量显著相关(P<0.05)。其中,HLJ3086、HLJ2642及HLJ3515与肌间刺数量极显著相关(P<0.01)。多重比较同一标记不同基因型,得到与肌间刺数量相关的基因型。将得到的与肌间刺数量显著相关微卫星标记在NCBI上进行BLAST比对,结果显示HLJ2891与斑马鱼编码蜘蛛毒素亲和蛋白-2(latrophilin-2-like)基因相似,一致度达92%,HLJ3515与斑马鱼编码丝氨酸/苏氨酸激酶32B(serine/threonine-protein kinase 32B-like)基因相似,一致度达81%。该结果为镜鲤肌间刺数量的分子标记辅助育种(molecular marker assisted breeding)提供了有效依据。     

利用微卫星分子标记分析四个中华绒螯蟹群体的遗传多样性

利用本实验室克隆的16个和国际上发表的8个微卫星标记,对4个中华绒螯蟹群体(江苏、安徽、辽宁、天津)的遗传多样性进行检测。所检测到的扩增片段长度为80—445bp,在群体间扩增出2—10个等位基因,共计155个等位基因,平均等位基因6.458个。4个中华绒螯蟹群体的平均有效等位基因数(Ne)为4.3491—4.7234,平均观察杂合度(Ho)为0.5690—0.6722,平均期望杂合度(He)为0.7238—0.7546,并通过基因型的P值,确定了7个座位处于Hardy-Weinberg平衡;同时对4个群体的遗传距离进行了估算,聚类分析结果表明,安徽、江苏、天津聚为一支,属于长江河蟹类型,辽河种群单独聚为一支。     

鲤鱼乳酸脱氢酶活性的QTL检测

利用SSR分子标记结合“拟测交”策略, 以荷包红鲤抗寒品系和柏氏鲤远缘杂交所产生F1代为亲本及其F2代为作图群体, 应用Windows Map Manager 2.0软件的标记回归法进行乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase, LDH)活性数量性状基因座单标记定位分析。在乳酸脱氢酶性状的标记回归研究中, 共发现12个标记与LDH性状关联, 对性状的贡献率为4.00%~10.00%, 其中HLJE222达到极显著水平(P<0.01)。为了进一步验证, 利用已有的生物信息学工具, 将与性状连锁的EST序列与公共数据库中的核酸序列进行同源搜索分析, 发现标记HLJE222的EST序列与斑马鱼DAZ associated protein 1的mRNA序列相匹配(相似性为94%), 与公共数据库中的已知蛋白序列进行相似性比较, 同样发现HLJE222的EST与斑马鱼DAZ associated protein 1相匹配(相似性为97%)。结果表明HLJE222位点与影响乳酸脱氢酶活性相关的基因连锁。     

用于目标序列染色体定位的镜鲤BAC-FISH体系构建

为了构建用于镜鲤(Cyprinus carpio var. specularis)特定基因组序列染色体定位的实验体系, 在细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromosome, BAC)文库筛选池中对已知短序列基因组片段进行PCR扩增, 筛选出包含目标序列的BAC克隆, 提取BAC质粒进行缺刻平移标记制备探针, 开展荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization, FISH)实验。通过对染色体片前处理、BAC质粒探针制备、C0t-1 DNA封闭基因组重复序列、预杂交、荧光染料选择、信号放大等一系列实验条件和方法的探索优化, 成功实现了目标序列在镜鲤有丝分裂中期染色体上的定位。定位对象既包括在染色体上有单一位点的序列, 如斑马鱼微卫星标记Z6884和Z4268, 也包括在染色体上有多个位点的重复序列, 如黄河鲤性别相关标记CCmf1。来自斑马鱼同一条染色体上的两个微卫星标记被分别定位于镜鲤不同染色体上, 为鲤鱼染色体数目加倍的进化假设提供了一项直接实验证据, 同时将现有遗传连锁图谱与染色体对应起来, 可作为染色体识别和细胞遗传学图谱构建的依据。黄河鲤性别相关重复序列被定位于不少于四条染色体上, 为性别决定相关基因的筛查提供了研究线索。这一BAC-FISH实验体系将成为鲤细胞遗传学图谱构建、基因组进化和比较基因组学研究中的重要研究工具。       

黑斑狗鱼部分基因组文库构建和微卫星位点的筛选

采用磁珠富集与放射性杂交相结合的方法开发黑斑狗鱼(Esoxreieherti Dybowski)基因组微卫星资源。基因组DNA经Sau3AⅠ限制性内切酶消化后,选取400―900bp的片段进行PCR全基因组扩增,并利用生物素标记的(CA)12、(GA)12探针进行微卫星片段的富集。将得到的片段与pGEM-T载体连接后转入DH5α大肠杆菌中,然后利用γ-32P标记的放射性同位素探针进行第二次杂交。结果,共获得微卫星基因组文库1600个菌,杂交前菌落PCR检测阳性克隆率为90.91%;杂交后得到的阳性克隆为1300个,占87.25%。从中挑出196个进行测序,192(97.96%)个含有微卫星序列。在得到的微卫星序列中,重复单元除CA/GT、GA/CT外,还观察到单碱基、四碱基、五碱基重复单元。根据侧翼序列应用引物设计软件PrimerPremier5.0设计引物70对,选择合成32对,通过优化PCR反应条件,结果有28对引物可扩增出清晰可重复的目的条带。本研究旨在对黑斑狗鱼基因组资源的开发利用起到一定的促进作用,并为黑斑狗鱼养殖品系的优化、遗传多样性的检测及遗传图谱的构建等奠定基础。     

黑斑狗鱼部分基因组文库构建和微卫星位点的筛选(英文）

采用磁珠富集与放射性杂交相结合的方法开发黑斑狗鱼（Esox reieherti Dybowski）基因组微卫星资源。基因组DNA 经Sau 3AⅠ限制性内切酶消化后,选取400―900 bp的片段进行PCR全基因组扩增,并利用生物素标记的（CA）12、（GA）12 探针进行微卫星片段的富集。将得到的片段与pGEM-T载体连接后转入DH5α大肠杆菌中,然后利用γ-32 P标记的放射性同位素探针进行第二次杂交。结果,共获得微卫星基因组文库1 600个菌,杂交前菌落PCR检测阳性克隆率为90.91%;杂交后得到的阳性克隆为1 300个,占87.25%。从中挑出196个进行测序,192（97.96%）个含有微卫星序列。在得到的微卫星序列中,重复单元除CA/GT、GA/CT 外,还观察到单碱基、四碱基、五碱基重复单元。根据侧翼序列应用引物设计软件Primer Premier 5.0设计引物70对,选择合成32对,通过优化PCR反应条件,结果有28对引物可扩增出清晰可重复的目的条带。本研究旨在对黑斑狗鱼基因组资源的开发利用起到一定的促进作用,并为黑斑狗鱼养殖品系的优化、遗传多样性的检测及遗传图谱的构建等奠定基础。