牙鲆CA/GT微卫星标记的筛选

采用生物素选择杂交法与放射性同位素杂交法相结合的技术,成功地从牙鲆(Paralichthys olivaceus)基因组中分离出含有CA/GT重复类型的微卫星序列。通过两轮淘选,共获得526个阳性菌落。测序其中的119个菌落,结果获得133个含有微卫星座位的序列。除了两个复合型微卫星外(1.5%),完美型63个(47.37%),非完美型68个(51.13%)。设计并合成22对微卫星引物,对8个人工雌核发育家系的亲本进行遗传背景分析。PCR结果表明,4对引物无扩增带或者扩增带不是目的条带,1对引物表现为单态,其余17对引物均呈多态性,平均每个座位产生5.2个复等位基因,杂合度为0.375～0.846,多态信息含量为0.305～0.823。结果表明,所筛选的大部分微卫星标记能够用于牙鲆群体遗传学研究。     

微卫星标记的制备策略

微卫星标记作为一类重要的、成熟的分子遗传标记,凭借自身的高变异性、孟德尔遗传模 式、共显性遗传方式等优点,在遗传及其它相关领域发挥了十分重要的作用,而其主要的缺点是 必须知道所研究生物的微卫星序列及其旁侧序列。随着人类及模式生物基因组的深入研究,微 卫星标记的制备经历了从费时、费力、低效的传统法到周期短、效率高的富集法(选择性杂交法和 FIASCO法);从基因组构建文库筛选到公共数据库ESTs发掘;从实验室自制到花钱购买。总之, 随着方法与技术的不断改进,从目标生物中获得微卫星标记变得越来越简单、经济。     

大黄鱼耐低温性状相关微卫星标记的筛选

鱼类的耐低温性状是一种重要的经济性状。为了初步分析大黄鱼的耐低温性状, 文章采用15对荧光微卫星标记, 以SSR-PCR方法对大黄鱼低温耐受组和正常对照组F₁代共40个个体进行了耐低温性状遗传差异分析。结果显示, 标记LYC0002在两组样品中共扩增出5个等位基因(片段大小分别为112 bp、110 bp、108 bp、106 bp和104 bp), 其中LYC00021_{12 bp}等位基因在低温耐受组的出现频率达60%, 而在正常对照组中的频率为零, 表明该等位基因对大黄鱼的温度敏感特性有较明显的偏好性, 可能与某种耐低温基因存在一定的连锁关系。此外, 对LYC0002_{106 bp、}LYC0002_{108 bp}、LYC0002_{110 bp} 和 LYC0002_{112 bp} 4个等位基因分别进行了回收、克隆及测序。序列比对结果显示, LYC0002_{112 bp}等位基因含有10个(CA)重复单元, 而其他3个等位基因依次缺失1个(CA)重复单元, 说明LYC0002在本研究样本中的突变方式为微卫星逐步突变模型(Stepwise mutation model, SMM)。     

Tgf2转座子多克隆位点的克隆与表达

以金鱼pTgf2-EF1α-EGFP转座子为基础,构建含有多克隆位点(Multiple cloning sites,MCS)序列以及外源目的基因肌醇-3-磷酸合成酶(Myo-inositol-3-phosphate synthase,MIPS)的重组表达载体并注射到斑马鱼1-2期受精卵,检测重组表达载体pTgf2-EF1α-MCS-EGFP和pTgf2-EF1α-MCS-MIPS-EGFP在斑马鱼中绿色荧光蛋白基因(EGFP)的表达情况以及外源基因MIPS在斑马鱼体内的整合情况。荧光观察结果显示,两个重组载体均不影响EGFP的表达,只是表达强度存在一定差异,表明对Tgf2转座子的改造是有效的。转基因斑马鱼PCR检测结果显示,靶基因MIPS的编码区能够完整地整合到斑马鱼基因组中,整合效率达31.4%。重组表达载体的成功构建显示金鱼Tgf2转座子可以介导外源基因在斑马鱼中的表达,为以后Tgf2转座子在鱼类基因功能研究方面奠定了基础。     

水产养殖动物遗传连锁图谱及QTL定位研究进展

自1997年美国农业部启动5种水产养殖动物基因组计划以来，在不到10年的时间里，世界各国都相继开展了本国主要水产养殖动物基因组研究。截至2005年底，有近17种海淡水养殖动物公布了遗传连锁图谱：属于高密度连锁图谱的有虹鳟和大西洋鲑(标记数超过1 000)；属于中密度遗传连锁图谱的有罗非鱼、沟鲶、黑虎虾、日本牙鲆和欧洲海鲈(标记数为400—1 000)；属于低密度遗传连锁图谱的有泰国的胡鲶，中国的栉孔扇贝、鲤鱼，日本的黄尾shi，美国的牡蛎等近10种养殖种类(标记数少于400)。水产养殖动物遗传连锁图谱的构建和发展，促进了一些与经济性状(如生长、抗逆、发育等)相关的数量性状位点(QTL)的定位研究。然而，QTL定位研究目前只在具有中高密度遗传连锁图谱的鲑科鱼类(虹鳟、大西洋鲑和北极嘉鱼)、罗非鱼、沟鲶和日本牙鲆等种类中开展，而且定位研究仍处在初级水平。遗传连锁图谱的高分辨率和QTL在图谱上的精确定位，是今后能否实现对主要水产养殖动物的经济性状进行遗传操作的技术保证，同时也是实现分子标记或基因辅助育种在水产养殖动物中成功运用的制胜法宝。     

双标准曲线相对定量PCR试验原理与方法

实时荧光定量PCR(FQ-PCR)是一种准确有效的核酸定量分析技术,具有易操作、高通量、高敏感性、高特异性、高度自动化和低污染等优点,并随新定量PCR仪及新操作方法的发展而得到广泛应用,但是,定量PCR的高敏感性特点使得实验操作严格而繁琐。阐述了一种改进的相对定量方法——双标准曲线法的试验原理和特点,描述了定量PCR体系的优化方式,探讨了试验误差分析方法及试验操作技巧,并就试验数据的处理方法进行讨论。试验证明,双标准曲线法是一种经济、简单而准确的定量方法。     

养殖大黄鱼一个繁育群体亲本亲缘关系剖析

该文利用23个微卫星标记对103尾大黄鱼繁育亲本进行遗传多样性检测和亲缘关系重建分析,并构建繁育体系指导大黄鱼配组。遗传多样性检测显示,103尾亲鱼在23个座位共获得等位基因数134个,平均5.82个,总平均观察杂合度0.599 3,表明该繁育群体尚保持一定水平的遗传多样性。采用似然率和组合优化法统计模型重建的同胞关系不尽相同,但结果均证实了这些繁育亲本亲缘关系十分相近。配组比对分析结果显示,两种方法的配组方案一致性高达85%,最终选择组合优化法的分组方案指导大黄鱼配组繁育。     

鲫属鱼类DNA条码及种与亚种划分

鲫属(Carassius)鱼类由于表型变异大,分布范围广,分类一直不完善。该属常被分为三个种:黑鲫(C.carassius)、白鲫(C.cuvieri)和鲫(C.auratus)。鲫又可分为多个亚种(包括金鱼),其中银鲫(C.auratus gibelio)亚种有时被视作一个独立的种。该文研究了线粒体细胞色素c氧化酶亚基I(COI)基因5’端651bp的片段在这些种和亚种(共计128尾标本)中的变异。结果表明,C.carassius、C.cuvieri和C.auratus均为有效种,同时欧亚大陆的与日本列岛的C.auratus有明显分化;而C.auratusgibelio和C.auratusauratus有一些共享的单倍型,C.auratus gibelio应被视为C.auratus的一个亚种,而不是一个有效物种。由于C.auratus auratus和C.auratus gibelio等类群中同时存在二倍体和三倍体,因此,倍性不宜作为种或亚种的划分标准。     

借助斑马鱼EST数据库从鲤鱼微卫星序列中寻找蛋白编码基因

应用in sifico的方法,利用Blastu和Blastx搜索引擎,将鲤鱼微卫星序列与GenBank数据库进行同源序列比对.利用Blastn,将侧翼序列长度＞50bp的875个鲤鱼微卫星序列与斑马鱼的EST数据库首先进行比对,结果找到了121个同源序列.随后采用Blastx搜索蛋白质数据库,有94个微卫星位点存在同源蛋白.除了33个假定和3个未知蛋白外,剩余的58个微卫星位点被成功地进行了功能注释,而且其中的7个位点已经定位在了鲤鱼连锁图谱上.另外,通过PCR-SSCP的方法,将两个与鲤鱼微卫星侧翼序列相匹配的斑马鱼EST序列开发成鲤鱼的STS标记,并将其中的一个标记HLJZe33定位到鲤鱼连锁图谱上.以上研究结果表明,通过比较基因组研究,模式生物斑马鱼的很多遗传和基因组资源都可以被利用到鲤鱼的基因组研究中.