黑斑狗鱼部分基因组文库构建和微卫星位点的筛选(英文）

采用磁珠富集与放射性杂交相结合的方法开发黑斑狗鱼（Esox reieherti Dybowski）基因组微卫星资源。基因组DNA 经Sau 3AⅠ限制性内切酶消化后，选取400―900 bp的片段进行PCR全基因组扩增，并利用生物素标记的（CA）12、（GA）12 探针进行微卫星片段的富集。将得到的片段与pGEM-T载体连接后转入DH5α大肠杆菌中，然后利用γ-32 P标记的放射性同位素探针进行第二次杂交。结果，共获得微卫星基因组文库1 600个菌，杂交前菌落PCR检测阳性克隆率为90.91%；杂交后得到的阳性克隆为1 300个，占87.25%。从中挑出196个进行测序，192（97.96%）个含有微卫星序列。在得到的微卫星序列中，重复单元除CA/GT、GA/CT 外，还观察到单碱基、四碱基、五碱基重复单元。根据侧翼序列应用引物设计软件Primer Premier 5.0设计引物70对，选择合成32对，通过优化PCR反应条件，结果有28对引物可扩增出清晰可重复的目的条带。本研究旨在对黑斑狗鱼基因组资源的开发利用起到一定的促进作用，并为黑斑狗鱼养殖品系的优化、遗传多样性的检测及遗传图谱的构建等奠定基础。