抗FLAG标签抗体在植物中的高效表达

植物生物反应器是一种新兴的重组蛋白表达系统,是分子农业的核心内容之一。本研究在本氏烟草(Nicotiana benthamiana)中表达了抗八肽(DYKDDDDK, FLAG)标签抗体,并对其进行纯化与鉴定。通过多次免疫小鼠获得高效价抗FLAG抗体并测出其编码序列,然后亚克隆至植物DNA病毒表达载体,最后通过农杆菌介导转染烟草叶片。经Western blotting检测了转染后2−9 d抗体的表达情况：3 d后FLAG抗体开始在烟草叶片中表达,5 d后表达量达到峰值,每千克鲜叶估计可表达66 mg FLAG抗体。抗体经过分离纯化后浓缩为1 mg/mL,按1:10 000稀释仍可识别1 ng/mL的抗原,表明植物生产的FLAG抗体具有高亲和力。植物生物反应器可用于生产高亲和力抗体,并具有简易、成本低和生产周期短等特点,具有很高的应用价值。     

融合蛋白NusA-hRI的高效异源表达、纯化及活性分析

人核糖核酸酶抑制因子 (human ribonuclease inhibitor, hRI) 是一种能够调节核糖核酸酶活性的酸性包浆蛋白。通过构建含SUMO、IF2、GST、NusA 、MsyB、Trx和 MBP融合标签的重组表达载体,以大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主菌进行自诱导(auto-induction,AI)表达,从而使 hRI 的表达量得以提升。利用MagNi磁珠纯化及电泳分析hRI的表达状况,通过RNase/Sepharose亲和层析获得纯度较高的蛋白。纯化后获得的融合蛋白浓度为2 960.513mg/L,与其它公司的hRI活性进行比较,检测其酶活性约为50U/μl,并使其成功用于RNA的保护,为NusA-hRI的应用提供理论依据。     

一种新型亮氨酸5-羟化酶NmLEH的异源表达、纯化及酶学性质分析 *

羟基化氨基酸是一种新型氨基酸衍生物,可广泛用作化工材料的前体物及医药合成的中间体。将来源于Nostoc minutum的新型L-亮氨酸5-羟化酶 (NmLEH) 通过重组质粒在大肠杆菌中异源表达。结果表明,在BL21(DE3) 宿主细胞中,诱导温度为25℃,IPTG诱导浓度为0.5mmol/L,诱导10h时,蛋白质表达量最高 (0.45mg/ml);通过Ni-亲和层析和凝胶过滤层析两步分离纯化获得了高度纯化的重组NmLEH蛋白;对NmLEH的酶学性质进行了表征,该酶的最适反应温度为25℃,最适pH 为7.5,在pH 7.0~9.0较为稳定,最适底物为亮氨酸和甲硫氨酸;同源序列分析表明NmLEH属于亚铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶家族[Fe(II)/αKG-Dos],并预测了该酶的保守催化活性位点(H150、D152、H236);通过同源建模得到了该蛋白质的模拟结构,分析了该蛋白质催化活性中心的形成机制。     

梯棱羊肚菌单孢及杂交群体的栽培出菇试验和极性分析

羊肚菌的极性和单孢出菇至今未有确切的实证,这限制了对羊肚菌生活史的深入理解和遗传育种工作的开展。本研究选用梯棱羊肚菌(Morchella importuna)栽培菌株(F0),采取显微操作从其正常出菇的子囊果获得F1单孢群体;随机选取其中的7个F1单孢菌株和10对单孢杂交(F1两两混合,记为F2)进行栽培试验,记录和分析了栽培出菇时间、采收期、产量和其他生产性状。此外,分析了F0亲本菌株、F1单孢群体、F2子囊果以及2个F1单孢菌株出菇的F2子囊果的F3单孢群体的交配型基因型。结果表明:除了F1单孢菌株MM32未出菇以外,其他供试菌株均正常出菇。各菌株的出菇潜能不同,3个F1单孢菌株的平均单产高于出发菌株,其中MM34菌株平均单产最高,达1.01 kg/m^2,是F0亲本菌株(0.68 kg/m^2)的1.49倍; 10个单孢杂交的F2平均单产在0.21～0.97 kg/m^2之间。F0亲本菌株和所有的F2出菇子囊果中均含有2种交配型基因,F1和F3单孢群体仅含有2种交配型基因中的1种。虽然F1单孢群体大部分菌株均正常出菇,然而F2子囊果和F3单孢群体的交配型基因型分析结果表明,单孢菌株在栽培生产中自然引入了具有相反交配型基因的细胞核,这种自然引入可能是由无性孢子传播引起。出菇试验和交配型基因分析确证梯棱羊肚菌为异宗结合真菌。本研究有利于深入理解羊肚菌生活史,促进羊肚菌育种工作的开展。     

思茅松毛虫肠道真菌分离鉴定及水解酶活性初步研究

肠道微生物在昆虫的食物消化、免疫防御中发挥重要作用,但目前对昆虫肠道真菌了解不多。本研究以重要林业害虫—思茅松毛虫Dendrolimu kikuchii Matsumura为材料,分离鉴定其幼虫中的肠道真菌。采用传统微生物分离纯培养的方法从思茅松毛虫4龄幼虫肠道样品中分离肠道真菌,运用ITS序列分析鉴定,并对其产酶活性初步研究。经同源序列比对分析,思茅松毛虫4龄幼虫肠道中共分离得到12株真菌,分别属于德巴利酵母属Debaryomyces sp.,拟盘多毛孢属Pestalotiopsis sp.,青霉属Penicillium sp.,弯担菌属Curvibasidium sp.。产酶活性研究表明8株菌产纤维素酶,9株菌产淀粉酶,7株菌产脂肪酶,2株菌产蛋白酶。DKF-8产淀粉酶能力最高,酶活力是60.907 U/mL。DKF-10产纤维素酶能力最高,酶活力是14.276 U/g,菌株DKF-6产蛋白酶活力是5.561 U/mL,菌株DKF-8产蛋白酶酶活力是2.918 U/mL。思茅松毛虫4龄幼虫肠道真菌物种丰富度较低。本实验为未来深入研究思茅松毛虫肠道微生物功能提供了菌株材料。     

棉铃虫Ⅰ型几丁质酶的表达

昆虫几丁质酶主要参与昆虫蜕皮、围食膜降解、细胞增殖、机体免疫防御、生长因子等重要生理生长发育过程。在本研究中,从NCBI下载棉铃虫几丁质酶序列,并克隆验证正确,构建的系统发育树表明属于Ⅰ型几丁质酶。将不包含信号肽的开放阅读框序列(1 707 bp)与pET28a载体连接,转化至大肠杆菌transetta(DE3)中进行诱导表达,Western blot进一步验证融合蛋白His-HaCHT。用镍柱子纯化融合蛋白,纯化获得的融合蛋白对胶体几丁质有降解活性,其酶活力为0.023μg/mL·s~(-1)。不同龄期的qPCR结果显示,该基因在棉铃幼虫的6个幼虫期以及预蛹蜕皮后均有表达,但HaCHTI在4龄和6龄幼虫阶段表达相对较高,而在1龄、2龄、3龄、5龄幼虫和预蛹表达量较低。这些结果表明,异源表达的棉铃虫的I型几丁质酶对胶体几丁质具有降解活性,可能对棉铃虫正常蜕皮有着重要的作用。     

棉铃虫Hsp70的多克隆抗体制备及鉴定

HSPs(热休克蛋白)是机体在不利环境条件刺激下合成的一类蛋白质,在进化上高度保守,普遍存在于生物体,其中Hsp70是最为保守的成员。研究发现,昆虫滞育过程中普遍存在Hsp70表达上调的现象。然而,现有的研究均是在基因水平的检测结果。为了能从蛋白水平检测棉铃虫中Hsp70的表达,本研究制备了棉铃虫Hsp70的多克隆抗体。构建了hsp70的原核表达载体并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,重组蛋白经镍柱纯化后免疫兔子,制备了棉铃虫Hsp70的多克隆抗体。抗体的效价较高,达到了1∶256 000,此外Western结果表明,制备的抗体能检测出热诱导的Hsp70蛋白。本研究制备了高效价且较为特异的Hsp70对克隆抗体,该抗体为后续从蛋白水平研究棉铃虫滞育过程中Hsp70的表达及其分子机制奠定了基础。     

三种车前草的黄酮提取、纯化及其抗氧化活性分析

本研究采用响应面设计优化超声辅助提取车前总黄酮的最佳条件,然后用此条件提取大车前和平车前总黄酮,并探究大孔树脂纯化对三种车前草总黄酮抗氧化活性的影响。结果表明,在超声温度60℃、乙醇浓度70%的条件下,车前总黄酮最佳提取工艺参数为液料比20:1 m L/g、超声时间80 min、超声功率210 W,车前、大车前和平车前的总黄酮得率分别为5.04%、2.86%和1.22%。无论是纯化前还是纯化后,大车前总黄酮的还原力和对羟基自由基的清除作用最强,平车前最弱;车前总黄酮对DPPH自由基的清除作用最大,平车前最弱。纯化前后的还原力和对DPPH自由基、羟基自由基的清除作用都接近Vc的水平。     

牛源流行性出血病病毒(EHDV)血清10型毒株在我国的分离鉴定

我国存在多种血清型流行性出血热病毒(Epizootic haemorrhagic disease virus,EHDV)的流行,但尚未有关于EHDV-10型毒株的分离报道。为了解云南省EHDV的流行情况,2012～2015年,本研究在云南省设立江城、师宗、芒市三个监控点,定期采集监控动物血液,接种幼仓鼠肾细胞(Baby hamster kidney cell,BHK-21)进行病毒分离;通过PCR检测、血清中和试验、琼脂糖凝胶电泳和电镜观察等方法对分离病毒进行鉴定;对分离毒株的Seg-2/VP2与Seg-3/VP3基因节段进行克隆、测序与序列分析。2013年在云南省师宗县的哨兵牛上分离出一株EHDV毒株(YNSZ-V277-2013),病毒可引起BHK-21细胞出现圆缩、裂解的细胞病变(Cytopathic effect,CPE);电镜下病毒粒子呈球形,无囊膜,表面有大量纤维突,直径在70～80nm之间;病毒基因组dsRNA的琼脂糖凝胶电泳显示分离毒株与其他血清型EHDV一致,呈现"3-3-3"的电泳带型;序列分析显示YNSZ-V277-2013毒株的Seg-2/VP2与Seg-3/VP3序列与日本EHDV-10型毒株(ON-4/N/98)相似度最高,分别为97.5%/98.5%与98.1%/99.8%,证实分离毒株为EHDV-10型;系统发育分析显示YNSZ-V277-2013毒株的Seg-2与日本EHDV-10型毒株(ON-4/N/98)的亲缘关系最近,Seg-3与分离至日本和澳大利亚的EHDV毒株同属Eastern型。本研究首次报道了EHDV-10型毒株在我国的分离以及分离毒株的Seg-2与Seg-3基因序列特征,为进一步开展中国EHDV-10型的流行病学调查与致病性研究提供了基础。