田头菇属不同分离菌株杂交研究

目的:验证杨柳田头菇菌株YAASM0711的性遗传模式,探索田头菇属不同分离菌株间的杂交结果.方法:对菌株YAASM0962、YAASM0969以及茶树菇CS45做了交配型与种间杂交研究.结果:菌株YAASM0962其性遗传模式为四极异宗结合,4种交配型比例A3B3∶A4B3∶A3B4∶A4B4为6∶10∶14∶7;菌株YAASM0969和茶树菇CS45出现偏分离现象,只有两种极性出现,2种交配型比例分别为(YAASM0969,A5B5∶A6B6)38∶35和(CS45,A7B7∶A8B8)51∶55.菌株YAASM0711与YAASM0962、YAASM0969、YAASM0967、CS45之间杂交能形成具锁状联合的双核菌丝,且除茶树菇外均能产生子实体.结论:除茶树菇CS45外其余的菌株为杨柳田头菇,它们的有性繁殖方式应该均为四极异宗结合,伴随人工的栽培,其交配因子基因之间不断的重组、插入或删除引发偏分离现象,导致极性菌株比例失调,甚至使一些极性丢失.     

扩增和纯化携带肌浆网钙ATP酶重组腺病毒的实验方法

目的:通过扩增和纯化rAd.SERCA2a,为转SERCA2a基因研究提供实验基础,并为建立基因库提供稳定可靠的实验方法.方法:用100μL 1.9×10<'12>pfu/ml rAd.SERCA2a感染HEK293细胞,出现细胞病变效应时收获细胞,经物理反复冻融方法及两步氯化铯超速离心方法获得纯化的rAd.SERCA2a,紫外分光光度计比色法测定病毒DNA质粒数.结果:rAd.SERCA2a成功在HEK293细胞表达呈现绿色荧光,纯化的rAd-SERCA2a-GFP DNA质粒数为1.3±0.58×10<'12>pfu/mL,OD<,260>/OD<,280>比值为1.57±0.49(n=50).结论:建立了稳定可靠的借助HEK293细胞培养扩增rAd.SERCA2a的实验方法,纯化后的高效价的SERCA2a基因的重组腺病毒可直接用于心力衰竭的实验研究,对重组腺病毒携带其他基因的扩增与提纯方法也具有一定的参考价值.     

鹰嘴豆种子胰蛋白酶抑制剂的分离纯化与鉴定

为了寻找具有药物作用的天然胰蛋白酶抑制物,采用硫酸铵分级沉淀、离子交换层析(DEAE-纤维素52)及Sephadex G-100凝胶层析等方法, 从鹰嘴豆种子中分离出一种鹰嘴豆胰蛋白酶抑制剂（CPTI）. 研究表明：CPTI对胰蛋白酶有较强的抑制作用,抑制率达80%,而对胰凝乳蛋白酶抑制作用较弱,抑制率为32%, 对胃蛋白酶、木瓜蛋白酶及枯草杆菌蛋白酶均无抑制作用; 用SDS-PAGE测得CPTI近似分子质量为25.7 kD; CPTI具有较高的热稳定性,在100 ℃下加热60 min,对胰蛋白酶活性仍保持78%抑制率; Lineveaer-Burk作图得知该抑制剂属竞争性抑制类型. 动力学测定显示,来自鹰嘴豆中的CPTI对胰蛋白酶的抑制作用常数(Ki)为3.99×10^-7 mol/L.     

密度梯度离心分离大鼠卵巢卵泡膜细胞

探讨用密度梯度离心法快速、有效地分离大鼠卵泡膜细胞.选取23～25 d雌性大鼠卵巢,用Percoll密度梯度离心法将卵泡膜细胞分离纯化,3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase,3β-HSD)组织化学染色用于卵泡膜细胞纯度检测.分别用0.1 U/mL和1.0 U/mL卵泡刺激素(Follicle-stimulating hormone,FSH)及黄体生成素(luteinizing hormone,LH)处理细胞,无血清培养48 h后,酶联免疫法检测培养液中雄烯二酮和雌二醇的水平.分离所得细胞中,3β-HSD染色阳性细胞与总细胞数之比大于90％; LH组的雄烯二酮水平显著高于对照组和FSH组(P＜0.05),LH组中1.0 U/mL组的雄烯二酮水平又高于0.1 U/mL组.各组均未检测到雌二醇及孕酮.3β-HSD组织化学染色可快速有效地检验所分离的卵泡膜细胞的纯度,分离所得的卵泡膜细胞可对LH产生反应,且其中几乎没有混杂颗粒细胞.     

幽门螺杆菌CagA蛋白N端片段的表达、纯化及其与磷脂酰丝氨酸的亲和力检测

目的:表达和纯化幽门螺杆菌不同菌株的CagA蛋白N端片段,检测其与磷脂酰丝氨酸(PS)的相互作用及亲和力。方法:用PCR方法从幽门螺杆菌3个菌株中扩增出CagA蛋白N端基因,并连接到表达载体pET-28a上;转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导可溶性表达CagA蛋白N端880残基片段;经镍柱亲和纯化后,利用PLOA法检测CagA蛋白与PS的相互作用。结果:构建了3种幽门螺杆菌菌株cagA基因的原核表达质粒pET-28a/cagAJ99、pET-28a/cagA11637及pET-28a/cagASS1,并在大肠杆菌中获得可溶性表达,SDS-PAGE和Western印迹证实得到目标融合蛋白,亲和纯化得到高纯度CagA蛋白。PLOA结果表明,CagA蛋白与PS有明显的相互作用。结论:3种幽门螺杆菌菌株CagA蛋白与PS之间存在相互作用,且不同的CagA与PS有不同的亲和力。     

基于Avi-tag技术的人胚肾细胞内增强型绿色荧光蛋白的生物素化、纯化和检测方法

目的:建立并优化基于Avi-tag标签技术的人胚肾细胞增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的定点生物素化标记、纯化和检测方法。方法:分别构建具有Avi-tag标签的eGFP真核表达载体plenti-Avi-eGFP和BirA酶真核过表达载体pQCXIH-BirA,将plenti-Avi-eGFP和pQCXIH-BirA共转染人胚肾293T细胞,12 h后观察Avi-tag标签对eGFP蛋白在细胞内定位的影响;48 h后裂解细胞,用链霉亲和素珠子纯化生物素标记的eGFP,SDS-PAGE观察eGFP纯化和富集情况,并优化基于Western印迹的生物素化eGFP检测方法。结果:Avi-tag标签对eGFP在细胞内的定位无影响,同时BirA酶在293T细胞内可将带Avi-tag标签的eGFP标记上生物素;生物素化的eGFP可特异性地被链霉亲和素珠子纯化和富集,纯度可达95%;Western印迹检测生物素化蛋白的最终条件为5%的BSA作为封闭液和终浓度为100 ng/mL的链霉亲和素-HRP。结论:建立了基于Avi-tag技术的人胚肾细胞内增强型绿色荧光蛋白的生物素化标记、纯化与检测方法,为该方法的广泛应用奠定了前期技术基础。     

GST-HRB融合蛋白的表达与纯化

构建GST-HRB重组质粒,进行融合蛋白的表达、纯化及鉴定.利用PCR扩增及基因重组技术,以pcDNA-3.1-HRB为模板扩增出HRB全基因序列,并将其插入带有GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签的原核表达载体pGEX-6P-1中,构建GST-HRB融合蛋白表达质粒.然后,将重组质粒GST-HRB转化至大肠杆菌Rosseta进行融合蛋白的表达.利用GST琼脂糖珠进行融合蛋白的纯化,最后应用SDS-PAGE电泳和Western blotting鉴定纯化的融合蛋白.结果表明,成功构建pGEX-6P-1-HRB原核表达载体,表达及纯化了GST-HRB融合蛋白.     

人热休克蛋白90AB1基因克隆、原核表达、中试发酵及纯化

通过克隆人热休克蛋白90AB1基因(Hsp90AB1),构建其原核表达载体pET28a(+ )-hHsp90AB1,表达纯化获得目的蛋白,为hHsp90靶向药物筛选奠定基础.提取宫颈癌HeLa细胞总RNA,并经RT-PCR获得hHsp90AB1-cDNA.以hH-sp90AB1-cDNA为模板进行PCR体外扩增,胶回收纯化hHsp90ABl.将hHsp90AB1及pET-28a(+)质粒经Nde I和Sal I双酶切、胶回收纯化酶切片段后,体外连接酶切片段,使其定向重组,再将重组DNA转化DH5α,经复苏后,在含卡那霉素的LB固体养基上筛选出阳性克隆.挑取LB固体培养基上的单菌落经酶切及测序鉴定,证实为阳性克隆,即pET28a-hHsp90AB1体外重组成功,命名为pET28a(+ )-hHsp90AB1.重组质粒转化Rosetta( DE3)菌株,IPTG诱导表达,并对表达条件优化,以及通过SDSA-PAGE和Western blotting分析均表明Hsp90AB1蛋白得到了正确的表达,且表达产物以可溶性形式存在,优化条件下蛋白表达量约占菌体总蛋白13％.接种到18 L发酵罐中试发酵,表达产物经Ni-NTA凝胶素和层析,蛋白纯度达到98％.     

绿色糖单孢菌木质素过氧化物酶的分离纯化及鉴定

木质素过氧化物酶是一种重要的具有工业应用前景的木质素降解酶,但已报道真菌来源的木质素过氧化物酶只能在酸性低温条件下发挥作用,限制了其进一步的工业应用.通过培养一株耐热耐碱放线茵——绿色糖单孢茵发酵产酶,采用DEAE-Cellulose,CM-Cellulose和Superdex 75凝胶过滤层析等分离纯化方法,得到一种具有耐热耐碱特性的木质素过氧化物酶.经凝胶电泳检测其为单一蛋白,分子量为41 kD.最终纯化倍数达到20倍,活性回收率为6％.采用LTQ法对纯酶进行蛋白质归类鉴定,得到其部分氨基酸片段,为该酶的进一步分子生物学研究奠定基础.     

《氨基酸和生物资源》2011年第33卷总目次

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