新疆紫草细胞生产阶段培养中细胞生长及产物合成的研究Ⅰ:悬浮培养

新疆紫草细胞生产阶段培养时生物产量随接种量的增加而增大,但生物量的倍增数并不增大.色素产量只在一定范围内与接种量成正相关关系,超过一定范围反而下降.当选定适当接种量时,加大培养基的浓度可提高色素产率.扩大培养规模,色素产量下降.     

新疆紫草细胞生产阶段培养中细胞生长及产物合成的研究Ⅱ:发酵培养

用内循环气升式反应器进行新疆紫草细胞生产阶段培养,当培养基浓度增加时,色素产率也随之提高,其数量及增长的幅度远大于悬浮培养。当接种量为180gFW／1,培养基为3倍的M9时能获得最大的色素产率：2．28g／l,是培养基非加倍时的5．4倍,太高的接种量不利于色素的合成。为降低成本而减少培养基中某些成份的用量时,要得到较高的色素产量,需同时调整其它成份的浓度。     

生物学因子对紫苏悬浮培养细胞生长和花色素形成的影响

应用摇瓶培养研究了生物学因子,即：细胞聚集体大小、继代周期和接种量,对紫苏悬浮细胞生长和次生代谢物花色素产生的影响。结果表明：与未经筛选的或细胞聚集体小于250μm的细胞团块相比,大于250μm的细胞团块作为接种细胞时,培养所得的花色素含量较低。7一10天为合适的继代周期,在长时期的继代过程中,细胞生长良好、并且色素含量也高。实验还表明,每升接种50克湿细胞最适合于细胞增殖与色素积累。     

商陆单细胞平板培养及色素高产细胞株的筛选

研究了细胞悬浮培养时间、培养方法和接种密度对商陆单细胞平板培养植板率的影响,建立了筛选色素高产细胞株的简单实用的方法。结果表明：普通单细胞平板时培养法培养商陆单细胞的植板率很低,而以悬浮培养１４－２１ｄ的单细胞为材料,接种密度为５＊１０＾３／ｍｌ时,进行条件培养和看护培养,植板率达１１．０２％。根据细胞平板培养结果,可在显微镜下直接观察单细胞克隆的颜色,筛选出商陆色素高产细胞株。     

雨生红球藻营养细胞的虾青素累积

接种于缺氮培养基的雨生红球藻。当置于光强为10—12klx,温度25℃±1.5℃条件下培养时,营养细胞迅速由绿色变成红色。接种4d时,运动细胞占细胞总数的90%,细胞内的虾青素含量(33.0pg/cell)占最终色素累积量的(60.0pg/cell)的55%。接种6d时,虾青素含量已占最终累积量的75%。电镜观察显示,红色的运动细胞除细胞质的大部分区域充满色素颗粒外,细胞的形态结构与绿色细胞基本一致。实验还表明,当接种物置于低光(0.5—1.0klx)下培养时,营养细胞仍有色素沉积,但累积缓慢。当只有高光胁迫(10—12klx,完全培养基培养)时,营养细胞转变成厚壁孢子后(5d后),才大量积累色素。     

Vitex glabrata R.Br.悬浮培养细胞的生长条件优化及20-羟基蜕皮激素的生产

研究了培养基、植物生长调节素以及接种量对Vitex glabrata R.Br.悬浮培养细胞的生长情况以及对20-羟基蜕皮激素形成的作用。当细胞在添加有2.0mg/LBAP(6-苯甲酸嘌呤)和1.0mg/L2,4-D的Gamborg’s B5培养基中培养时细胞生长和20-羟基蜕皮激素的形成达到了最高水平。当接种量为20%PCV(积压细胞体积)时观察到了20-羟基蜕皮激素的最高产量,大约是1.1mg/(L.d)。实验数据也表明当接种量增加到20%PCV时,产量提高了7倍。     

除虫菊细胞的悬浮培养

除虫菊悬浮细胞从培养后第8天开始迅速生长,14 d达到最大生长量,其最适培养基为:MS 4mg·L-12,4-D 0.1mg·L-1NAA 0.3 mg·L-16-BA 30 g·L-1蔗糖,最适接种量为15 g·L-1,摇瓶装液的体积分数为40%,初始培养的最适pH值为5.8,收获时pH下降为4.6±1,最适培养温度为25℃.     

外循环气升式反应器培养新疆紫草细胞

采用两步培养法进行新疆紫草细胞悬浮培养及5L外循环气升式反应器扩大培养,探讨了培养过程中细胞生长、紫草色素合成与培养液的电导率、可溶性糖含量变化之间的关系。第一步培养时细胞生长迅速,但也有一部分色素合成,电导率及可溶性糖含量迅速下降;第二步培养初期电导率也开始下降,但当色素合成达到高峰并有一部分外泌到培养基后,电导率又开始回升。可溶性糖捎耗很快,到后期巳测不出其存在。因此通过监测培养液中电导率及可溶性糖的变化情况,可以为新疆紫草细胞大规模培养与色素合成提供有用的参数指标。     

Vitex glabrata R.Br.悬浮培养细胞的生长条件优化及20-羟基蜕皮激素的生产

研究了培养基、植物生长调节素以及接种量对Vitex glabrata R.Br.悬浮培养细胞的生长情况以及对20-羟基蜕皮激素形成的作用。当细胞在添加有2.0mg/L BAP (6-苯甲酸嘌呤)和1.0mg/L 2,4-D的Gamborg's B5培养基中培养时细胞生长和20-羟基蜕皮激素的形成达到了最高水平。当接种量为20％PCV（积压细胞体积）时观察到了20-羟基蜕皮激素的最高产量,大约是1.1mg/(L·d)。实验数据也表明当接种量增加到20％PCV时,产量提高了7倍。     

Vitex glabrata R.Br.悬浮培养细胞的生长条件优化及20-羟基蜕皮激素的生产

研究了培养基、植物生长调节素以及接种量对Vitex glabrata R.Br.悬浮培养细胞的生长情况以及对20-羟基蜕皮激素形成的作用。当细胞在添加有2.0mg/L BAP (6-苯甲酸嘌呤)和1.0mg/L 2,4-D的Gamborg's B5培养基中培养时细胞生长和20-羟基蜕皮激素的形成达到了最高水平。当接种量为20％PCV（积压细胞体积）时观察到了20-羟基蜕皮激素的最高产量,大约是1.1mg/(L·d)。实验数据也表明当接种量增加到20％PCV时,产量提高了7倍。     

红酵母产类胡萝卜素固态发酵工艺条件的研究

该文研究了红酵母菌株D固态发酵产类胡萝卜素的培养基配方和发酵条件,得到初步优化的培养基为:啤酒糟∶豆粕∶麸皮=1∶3∶2.通过正交试验优化的培养条件是培养基含水量为60%,装量为6/150(即6g干基按设计的初始含水量用盐溶液配好后装于150ml三角瓶中),接种龄为24h,无机盐为0.5g/L MgSO4,其色素产量为14.2μg/g干基。色素产量随接种量增大而增大,细胞生物量、类胡萝卜素产量和含量均随发酵时间的增加逐渐增加,在96h分别达到最大值67.75mg dry-cell/g干基、9.88μg/g干基、145.80μg/g dry-cell,确定其最佳发酵周期为96h。     

用微载体悬浮培养系统增殖细胞和病毒

我们用我院制备的MC-1型微载体成功地培养了BHK-13,BHK-21,和CHO-KI三株细胞。当微载体浓度为5mg/ml,细胞接种量为30×10~4细胞/ml左右时,一般在三天都可达到1×10~6细胞/ml。此时接种10~(-1)或10~(-2)的VSV,在37℃培养20-24小时,病毒产量可达到6LogTCTD_(50)/ml以上,其中以CHO-KI细胞的产量最高,它们与静止培养的细胞产量基本一致,也不亚于鸡胚细胞增殖的产量。目前用该系统增殖的VSV已用于IFN的研究工作中。实验的结果也表明,用该系统增殖其它病毒和制备疫苗,以及大量培养已引入重组IFN基因的CHO工程细胞也将是可行的。     

中间产物对玫瑰茄培养细胞合成花青苷的影响

用Ｂ５培养基悬浮培养产色素的玫瑰茄培养细胞,培养１３天时,花青苷产量最高,为０．２５ｇ／Ｌ。培养基中添加终浓度为１０＾－６ｍｏｌ／Ｌ的外源Ｌ－Ｐｈｅ能够显著地增加产色素细胞花青苷的积累量。浓度为１０＾－７ｍｏｌ／Ｌ的槲皮素,可使悬浮培养的玫瑰茄细胞花青苷产量提高１．３倍,无论是Ｌ－Ｐｈｅ还是槲皮素均不能启动不产色素的细胞系产花青苷。     

MDCK细胞微载体培养条件优化研究

研究细胞接种量、搅拌转速和微载体浓度对MDCK细胞微载体培养时的影响,以合理优化MDCK细胞微载体培养最大增殖时期的最优条件,对疫苗和病毒分离具有重要意义,以期达到在疫苗和病毒分离领域提高生产效率。采用微载体培养MDCK细胞,在不同搅拌转速、微载体浓度和细胞接种量进行培养,每隔24 h取样计数,确定最优的培养条件。结果表明,细胞接种量在20个/球、搅拌转速45 r/min和载体浓度在2 g/L时,MDCK细胞的增殖较快,细胞密度较大,细胞的密度最大可达15.6×106个/mL,适合MDCK细胞增殖生长。     

磷对悬浮培养的西红花细胞生长和色素合成的影响

研究了磷对悬浮培养的西红花细胞生长、色素合成和主要营养物质吸收利用的影响。结果表明:不同初始磷浓度(低磷0.272 mmol/L、中磷0.544 mmol/L、高磷0.816 mmol/L)下西红花细胞均经历延滞期(0~3 d)、快速生长期(低、中磷3~15 d,高磷3~12 d)、稳定期(低、中磷15~21 d,高磷12~18 d)和衰亡期(低、中磷21~39 d,高磷18~39 d)这4个阶段,生长曲线呈S形。培养过程中比生长率呈下降趋势,磷对比生长率有一定影响。培养前9 d高磷下比生长率最高,中磷次之,9 d后高磷下的比生长率快速下降,中磷最高。进入快速生长期色素开始合成,到衰亡期色素仍继续合成,并且色素含量达到最高,随后色素开始降解,含量下降,色素合成期比细胞生长期长。因此,西红花细胞培养过程中色素合成与细胞生长不完全同步,属于部分耦联型。培养过程中色素比合成率呈上升趋势,磷对色素比合成率有一定影响。中磷浓度下色素比合成率最高。在快速生长期前期(6 d)质量分数95%蔗糖被降解为葡萄糖和果糖而被细胞吸收利用,培养18 d时质量分数85%葡萄糖被吸收利用,21 d时质量分数85%果糖被细胞吸收利用。培养3 d时胞外摩尔分数95%NH+4被细胞迅速吸收利用,而NO-3吸收利用较为缓慢,21 d时摩尔分数80%NO-3被吸收利用。提高初始磷浓度,果糖和NO-3的吸收利用速率亦随之提高,同时发现提高NO-3的吸收利用速率是提高色素合成能力的关键,高磷条件下细胞对NO-3的吸收利用速率显著提高。稳定期后期80%以上的营养物质被吸收利用,碳、氮源的不足影响了细胞生长,但对色素合成影响不大。     

固定化培养和产物释放促进剂对硬紫草细胞代谢的影响

固定化培养的硬紫草细胞生长缓慢,仅包埋球外层的细胞生长明显。其蛋白质合成的量也低。培养３０ｄ的细胞色素产量达到４．２ｍｇ／ｇＦＷ,相对色素分泌量达到７０％,而色素的组成成分及各组分的比例也与悬浮细胞的不同。以正十六烷处理固定化细胞可促进产物释放,其不同的处理时间对细胞没有显著影响。连续培养的固定细胞保持其色素形成能力达８０ｄ之久,色素总产量达２０ｍｇ／ｇＦＷ。     

固定化培养和产物释放促进剂对硬紫草细胞代谢的影响

固定化培养的硬紫草细胞生长缓慢,仅包理球外层的细胞生长明显,其蛋白质合成的量也低。培养３０ｄ的细胞色素产量达到４．２ｍｇ／ｇＦＷ,相对色素分泌量达到７０％,而色素的组成成分及各组分的比例也与悬浮细胞的不同。以正十六烷处理固定化细胞可促进产物释放,其不同的处理时间对细胞没有显著影响。连续培养的固定细胞保持其色素形成能力达８０ｄ之久,色素总产量达２０ｍｇ／ｇＦＷ．     

藏红花细胞悬浮培养体系的建立及优化

基于诱导的藏红花细胞系,通过摇瓶法,优化了其液体培养基、接种量和种龄等培养条件,以建立藏红花细胞悬浮培养体系。结果表明,将生长在固体培养基上的藏红花愈伤组织接种在MS液体培养基(添加了2mg/L2,4-D,1mg/L6-BA和300mg/LCH)中,于(22±0.3)℃,120r/min的摇床上,暗培养30d,便可获得藏红花的悬浮细胞系。经优化其培养基、接种量和种龄,将种龄为20d的细胞系,按照5%接种量接种在液体B5培养基(添加了2mg/LNAA,1mg/L6-BA和300mg/LCH)中,于(22±0.3)℃,120r/min的摇床上,培养36d,细胞生物量(13.4g/L)和藏红花素产量(0.91g/L)均达到最高。本研究建立的藏红花细胞悬浮培养体系为其生物反应器放大培养奠定了基础。     

微囊化重组CHO细胞制备和培养条件的优化

微囊化重组基因细胞移植治疗肿瘤是一种新兴的肿瘤基因治疗方法,然而由于目前微囊化细胞规模化制备和培养技术还不成熟,阻碍了其在临床治疗中的推广与应用。以重组CHO细胞为模型,考察了不同的微囊制备和培养条件对微囊化细胞生长和内皮抑素表达的影响。实验表明,种子细胞所处的生长阶段和细胞接种密度对微囊化细胞生长和内皮抑素表达的影响较大,对数生长期的细胞进行包囊并且细胞接种密度为1×106~2×106cells/mL微囊时微囊内细胞生长良好、内皮抑素表达量高。微囊制备时间对细胞活性和内皮抑素表达也有较大的影响,制备时间延长对细胞的损伤增大,因此制备时间应控制在5h以内。生物微胶囊在制备过程中会造成细胞损伤,而体外培养是恢复细胞活性的良好方法,在培养过程中微囊接种量为5%时对细胞生长和内皮抑素表达有利。     

磷对霍山石斛类原球茎悬浮培养细胞生长和多糖合成的影响

在确定了最适接种量和外植体细胞生理时间的基础上,研究了在不同起始磷浓度下,霍山石斛类原球茎生长、碳、氮消耗和多糖积累的动力学特性。以生长30d的类原球茎为材料,在接种量为100g/L时,类原球茎生长的最佳起始磷浓度为2.5mmol/L,培养36d时,类原球茎鲜重达496.5g/L。动力学分析表明,磷是霍山石斛类原球茎生长的限制性因素,胞内磷的积累水平与细胞生长具有相关性,2.5mmol/L的磷酸盐有利于碳、氮等营养物质的吸收;而多糖积累的最佳起始磷浓度为0.312mmol/L,培养36d时,其产量为2.22g/L。