中国人促红细胞生成素cDNA的克隆及其在COS—7细胞中的表达

利用PCR技术,以中国人促红细胞生成素(EPO)次全基因组为模板,进行了基因修补和重组,克隆出EPO cDNA全序列。同时发现中国人EPO cDNA与国外的克隆比较有一个核苷酸的差异,导致第62位氨基酸是丝氨酸,不是亮氨酸。将人EPO cDNA基因插入表达载体pSV2-dhfr中的不同克隆位点,构建了6种不同的转移载体质粒,即pSV2-dhfr/F1,pSV2/N2,pSV2-dhfr/F3,pSV2-dhfr/P4,pSV2-dhfr/G1和pSV2-dhfr/G3。将它们分别转染导入COS-7细胞,结果表明6种转移载体质粒转染的细胞上清液都有明显的EPO活性。人EPO cDNA基因转移载体质粒在COS-7细胞中的表达水平高于人次全EPO基因组转移载体质粒。     

重组人红细胞生成素二聚体不同真核表达载体的构建及表达

为构建重组人红细胞生成素(recombinant human erythropoietin,rhEPO)二聚体真核表达载体,应用PCR方法扩增EPO cDNA,PCR产物克隆入T载体后,经酶切、连接、转化等过程分别构建了3个EPO二聚体的真核表达载体pBT-1c、pBT-2s及pBT-3c,经测序序列完全正确。然后将3个真核表达载体分别转染于CCS-7细胞及CHO-dhfr-细胞中,用ELISA方法检测,它们在COS-7的瞬时表达量分别为4IU／ml、11.5IU／ml和7.2IU／ml。其中EPO二聚体真核表达载体pBTsv稳定转染CHO-dhfr-细胞后,用氨甲喋呤(MTX)逐渐加压的方法筛选到阳性克隆,表达量可达到4000IU／106cells／72h。     

通用真核质粒表达载体的构建

利用真核基因表达调控的原理,以pSV2-dhfr为起始材料,构建了两个通用的真核质粒表达载体pMAML1-dhfr和pMAML2-dhfr,它们包含人巨细胞病毒立即早期启动子/增强子调控元件,由两个转录方向相同或相反的表达单元组成.以荧火虫荧光素酶基因为报道基因,β-半乳苷酶基因为内对照,借助COS-7短暂表达系统,研究了它们对荧光素酶表达的影响,并比较了它们与出发载体pSV2-dhfr的相对强弱.     

人红细胞生成素工程细胞株的特性鉴定

目的：为了对人红细胞生成素工程细胞株(F10—6)进行特性鉴定。方法：将人红细胞生成素基因构建的重组表达质粒pCDB与标志质粒pSV—dhfr共转染CHO-dhfr^-细胞中,经氨甲喋呤加压筛选和亚克隆挑选,获得高效稳定表达EPO的工程细胞株并对其进行鉴定。结果：实验结果表明,工程细胞株无细菌、支原体、真菌和病毒污染;并无致瘤性;染色体数目不变;连续传代50次和三次冻存复苏后,细胞表达稳定。结论：该工程细胞株可用于工业化生产。     

小鼠白细胞介素33真核表达质粒的构建及表达

克隆小鼠IL-33基因构建其真核表达质粒,并转染COS-7细胞检测其表达。提取C57BL/6小鼠肺组织总RNA,经反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增小鼠IL-33基因,酶切后插入pcDNA^TM3.1/myc HisA构建其真核表达质粒pcDNA-3.1-IL-33,重组质粒转染COS-7细胞,RT-PCR和免疫印迹法（western blotting）检测目的基因表达。结果显示,pcDNA3.1-IL-33中插入的片段序列测定结果与小鼠IL-33cDNA序列一致,重组质粒转染COS-7细胞后检测到相应mRNA及蛋白表达。成功克隆了小鼠IL-33基因cDNA,并构建其真核表达质粒。     

人尿激酶原cDNA在中国仓鼠卵巢细胞(CH0)中高效表达研究

通过构建高效表达载体,改进转染方法,与二氢叶酸还原酶(dhfr)基因共扩增等手段在CH0细胞内高效表达了人尿激酶原(Pr0-UK)cDNA。首先将pro—UK cDNA插入到sR α启动子的下游,构建成表达质粒pMGl0102,在cos－7细胞内进行暂时性表达,结果表明此启动子的表达水平比SV40早期启动子高约5倍。然后将质粒pMG10102和pSV2－dhfr线性化后用磅酸钙共沉淀法转染CH0－dhfr-细胞,经一系列筛选后获得20个能表达pro—UK的细胞克隆,纤维蛋白溶解平板法(FAPA)测定表达水平为12．5—100IU／10⁶cells／d．再经MTX加压共扩增,得到9株高表达细胞系,其中最高的表达水平达到400—500Iu／10‘cells／d。2—3个月连续传代,表达水平未下降,表明细胞株是稳定的。Western Blot分析证明细胞分泌的重组pro－UK具有与天然pro—UK相同的分子量,而且培养液中不加蛋白酶抑制剂时,分泌的重组UK大部分为单链(60％以上)。     

鹅源新城疫病毒ZJI株基因组cDNA克隆的序列修饰

将鹅源新城疫病毒ZJI株全基因组cDNA克隆通过酶切切下包含T7启动子区域和转录载体的片段,将其自身环化后获得约6．5kb的质粒。设计引物,利用基因定点突变技术,在此质粒上T7启动子与NDV Leader序列之间突变插入额外的3个G碱基,将此突变最终引入到原基因组cDNA克隆中。应用RT—PCR技术从尿囊液中扩增NDV基因组F／HN基因区域部分片段,利用限制性内切酶BsmBI将扩增片段连接,最终将原cDNA克隆中相应片段替换下。测序结果表明,原基因组cDNA克隆中特定位置碱基插入突变成功,F／HN基因区域碱基突变均得以纠正。以上cDNA克隆的修饰与替换为该毒株的反向遗传研究打下了基础。     

结核分枝杆菌Rv3586结构域基因真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)环二腺苷酸(cyclic diadenosine monophosphate,c-di-AMP)合成酶Rv3586结构域基因的真核表达载体,并在COS-7细胞中表达。方法:以Mtb基因组为模板PCR扩增Rv3586三个结构域基因,分别克隆入pEGFP-N3真核表达质粒,用菌落PCR、质粒酶切和测序方法对插入序列进行鉴定。通过脂质体将重组质粒转染COS-7细胞,间接免疫荧光法检测目的基因在COS-7细胞内的表达。结果:PCR成功扩增出Rv3586三个结构域基因,菌落PCR、质粒酶切和质粒测序鉴定结果表明成功插入目的片段,包含Rv3586的三个结构域基因的真核表达载体构建成功。间接免疫荧光法结果显示,Rv3586三个结构域蛋白在COS-7细胞中表达成功。结论:成功构建Rv3586三个结构域基因的真核表达载体,并在COS-7细胞中表达成功,为后续Mtb Rv3586结构域的功能和应用研究奠定了基础。     

红细胞生成素cDNA在中国仓鼠卵巢细胞中的稳定表达

将(?)红细胞生成素(EPO)cDNA构建的重组表达质粒用电穿孔法引入COS-7细胞,ELISA和红系集落测活结果表明,该重组质粒在哺乳动物细胞中能够表达有生物活性的红细胞生成素。进一步将其转染CHO-dhfr~-细胞,经氨甲喋呤(MTX)加压扩增,混合细胞中各克隆表达水平比较一致,细胞的平均表达水平为2-3μg/10~6 Cells/24hr。细胞冻存后复苏其表达水平与冻存前一致,表明外源基因整合稳定。     

大鼠促甲状腺激素释放激素受体1基因的克隆及其在COS-7细胞系中的表达

目的:克隆大鼠促甲状腺激素释放激素受体1(TRH-R1)基因,构建其真核表达载体,并检测该基因在非洲绿猴肾细胞系COS-7中的表达。方法:应用RT-PCR方法,以大鼠脑源RNA为模板,扩增获得TRH-R1基因,定向克隆到pDsRed2-N1中,以LipofectAMINE 2000试剂转染pDsRed2-N1-TRH-R1表达载体至COS-7细胞系中进行瞬时表达。结果:测序结果表明,从大鼠脑源总RNA中克隆到正确的TRH-R1基因全长编码序列;显微照相观察到所构建的TRH-R1表达载体质粒在COS-7细胞系中获得有效表达。结论:大鼠TRH-R1基因的克隆、真核表达载体的构建及在COS-7细胞系中表达获得成功,为进一步研究其功能奠定了基础。     

tPA突变体在哺乳动物细胞中的表达

利用携带有二氢叶酸还原酶(dhfr)基因的pCI载体,实现tPA突变体(FrGGI)在CHO-dhfr^-细胞中的高效表达,获得高表达细胞株。采用分子克隆常规技术,将去除3’端非蛋白编码区的tPA突变体cDNA与pCI载体连接,构建真核表达载体pCI—tPA;采用阳离子脂质体转染法转染CHO-dhfr^-胞。经酶切及测序鉴定,证明所构建的质粒正确,转染CHO—dhfr细胞后,经过MTX加压筛选,得到了10株表达水平较高的细胞株,其活性可达每106细胞4000U／24h。以上结果为进行tPA突变体工程细胞株的筛选奠定了基础。     

人β-干扰素重组质粒在CHO-dhfr~-细胞中表达水平与MTX的关系

人IFNβ基因编码序列与pSC_7-dhfr~-载体重组构建的由SV_(40)早期启动子控制的组成性表达cDNA克隆,转染CHO-dhfr~-细胞,用氨甲喋呤(MTX)逐渐加压,观察其表达情况。二氢叶酸还原酶(dhfr)有一特性,其基因拷贝数可在MTX的选择压力下扩增,     

pcDNA3.1（＋）-LYVE-1真核表达质粒的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的 构建人淋巴管内皮细胞特异标志物LYVE-1融合基因表达质粒,观察其在COS-7细胞中的表达,为进一步探讨该标志物在肿瘤淋巴转移中的作用提供工具.方法 从本院结肠癌根治术患者术所取组织中的淋巴结抽提总RNA,RT-PCR扩增LYVE-1基因片段,并将其插入pMD19-T Simple Vector进行测序,鉴定正确后构建pcDNA3.1（＋）-LYVE-1并转染COS-7细胞,RT-PCR、Western印迹检测目的 蛋白表达,间接免疫荧光检测该基因表达在COS-7细胞上.结果 成功获取了人淋巴管内皮细胞特异标志物LYVE-1全长cDNA,构建了其真核表达载体pcDNA3.1（＋）-LYVE-1,转染COS-7细胞后检测出目的 蛋白的表达,并且证明该基因表达在细胞上.结论 成功构建了pcDNA3.1（＋）-LYVE-1重组质粒,为进一步研究LYVE-1在肿瘤淋巴管转移中的功能提供了重要的实验材料.     

p53 cDNA的克隆及在CV-1细胞中的表达

构建了可在哺乳动物细胞表达人p53基因的重组质粒pSV2neo-p53,并通过脂质体lipofectin介导转染猴肾细胞CV-1,用新霉素类抗生素G418筛选出阳性克隆。用原位杂交法检测转化细胞中的p53 mRNA;用免疫组化ABC法证明转化细胞的胞核中有p53蛋白表达。     

人β干挠素基因在SV40晚期启动子控制下在小鼠骨髓瘤细胞中表达

人成纤维细胞干挠素(Hu-IFN-β)基因的HindⅡ片段,插入载体pSV2-dhfr质粒中SV40晚期启动子(Lp)下游PvuⅡ位点处。用此重组质粒与带有黄嘌呤磷酸核糖转移酶(XGPRT)基因的质粒pSV2-gpt共转染次黄嘌吟核糖转移酶(HGPRT)基因缺陷的小鼠骨髓瘤(SP2/0)细胞。在含有霉酚酸和氨基喋呤的选择培基中,筛选出有效地组成性表达的细胞株。在未加氨甲喋呤压力倍增的条件下,Hu-IFN-β抗病毒活性为1275U/10~5细胞,1ml,48小时。     

鹅源新城疫病毒ZJI株基因组cDNA克隆的序列修饰*

将鹅源新城疫病毒ZJI株全基因组cDNA克隆通过酶切切下包含T7启动子区域和转录载体的片段,将其自身环化后获得约6.5kb的质粒。设计引物,利用基因定点突变技术,在此质粒上T7启动子与NDV Leader序列之间突变插入额外的3个G碱基,将此突变最终引入到原基因组cDNA克隆中。应用RT-PCR技术从尿囊液中扩增NDV基因组F/HN基因区域部分片段,利用限制性内切酶BsmB I将扩增片段连接,最终将原cDNA克隆中相应片段替换下。测序结果表明,原基因组cDNA克隆中特定位置碱基     

人TIMP-1 cDNA克隆、真核表达载体构建及在COS-7细胞中的表达

根据 Gen Bank中 TIMP- 1基因的碱基序列 ,用 RT- PCR方法从人的正常肾组织中克隆出包含信号肽在内的 TIMP- 1全长 c DNA序列 .采用 T- A克隆的方法将之插入 p CRR2 .1中间载体 ,DNA测序证实该片段序列与文献报告的完全一致 .利用亚克隆的方法将 TIMP- 1 c DNA片段克隆到 pc DNA3载体上 ,构建出 pc DNA3/ TIMP- 1的真核表达载体 ,通过脂质体 DOTAP转染至 COS-7细胞 ,Northern印迹及原位杂交证实在 COS- 7细胞上获得人 TIMP- 1的高效表达 ,细胞增殖实验表明 TIMP- 1的高产表达可促进 COS- 7细胞的增殖 ,证实了所转染人 TIMP- 1的生物活性     

含G0S2基因启动子的荧光素酶报告基因载体的构建

目的:克隆人G0S2基因启动子并构建荧光素酶报告基因载体,为进一步研究G0S2基因转录调控提供质粒。方法:利用PCR技术从人胚肾293A细胞基因组DNA中克隆获得G0S2基因启动子的DNA片段,将其克隆至pGL3-basic表达载体中,并转化人大肠杆菌DH5α,经限制性内切酶酶切、PCR及测序鉴定得到确认;将重组载体质粒与半乳糖苷酶表达质粒psV-β-Galactosidase共转染至大鼠血管平滑肌细胞(VSMC),检测细胞中荧光素酶的活性。结果:pGL3-G0S2-Promoter重组质粒插入片段和相邻序列正确,克隆的G0S2基因片段有启动子活性(P0.05)。结论:成功构建了pGL3-G0S2-Promoter报告基因质粒,为进一步研究G0S2基因的表达奠定了基础。     

GDF5基因真核表达载体的构建及其在恒河猴骨髓间充质干细胞中的表达

目的克隆人软骨组织生长分化因子5（GDF5）基因及构建GDF5基因真核表达载体,观察其在恒河猴骨髓间充质干细胞（MSCs）中的表达情况。方法采用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）从人胎儿软骨组织克隆hGDF5基因全长cDNA,插入pEGFP-C2载体,构建重组真核表达质粒pEGFP-C2-GDF5。重组质粒脂质体介导法转染MSCs细胞,荧光显微镜观察报告基因的表达,RT-PCR法检测目的基因表达。结果成功克隆人软骨组织GDF5基因和构建GDF5真核表达质粒pEGFP-C2-GDF5,克隆在载体上的基因长度为1505bp,包含全部cDNA编码序列1505bp,测序显示与Genbank上的序列一致。重组质粒转染恒河猴MSCs细胞得到表达,绿色荧光蛋白在转染24h后开始表达,72h达高峰,然后表达逐渐减弱。转染后72h可检测到GDF5mRNA表达。结论人GDF5基因在恒河猴MSCs细胞的成功表达为应用恒河猴模型开展基于细胞的基因疗法修复骨和软骨损伤研究奠定了必要基础。     

重组人粒细胞集落刺激因子Cdna在哺乳动物细胞中高效表达的研究

利用PCR反应、DNA测序、基因重组等技术,构建了两个表达人粒细胞集落刺激因子cDNA的重组质粒pED－GCSF和pEF－GCSF,两质粒分别转染COS7细胞作瞬时表达,转染CHO－dhfr－细胞作稳定表达。结果两质粒在COS7细胞和CHO细胞均获得了表达,pED－GCSF转染COS7细胞48h、72h的表达量分别为5.2×10⁴pg/ml和2.3×10⁵pg/ml,pEF－GCSF转染COS7细胞后48h、72h的表达量分别为2.8×10⁵pg/ml和1.4×10⁵pg/ml。转染CHO－dhfr－细胞,随着加入的氨甲喋呤(MTX)浓度升高,CHO－dhfr+克隆数减少,但平均每个克隆的rhG－CSF表达量升高,在0.5μmol/L MTX下最高表达rhG－CSF细胞株的量是4.46μg/ml/3d。且表达的rhG－CSF注射小鼠腹腔可提高小鼠外周血白细胞的数量。