CglI基因在大肠杆菌中的功能活性分析

通过PCR技术从谷氨酸棒杆菌基因组中扩增CglⅠ基因,克隆到载体pMD18-T Simple后测序.将CglⅠ基因亚克隆到表达载体pJL23,构建重组质粒pJL23-GglⅠ,转化大肠杆菌HB101菌株,通过PCR反应筛选鉴定阳性克隆.通过噬菌体感染实验,初步分析了CglⅠ基因在大肠杆菌中的功能活性.     

大肠杆菌ubiC基因的克隆及序列分析

研究以克隆得到正确序列的大肠杆菌ubiC基因目的,实验通过PCR方法从大肠杆菌基因组中扩增得到了ubiC基因,扩增产物克隆到pUC118载体,转化大肠杆菌JM109,DNA序列分析结果表明克隆得到的大肠杆菌ubiC基因碱基序列正确。     

葡萄白藜芦醇合成酶基因的克隆

为了构建白藜芦醇合成酶(RS)基因的克隆载体,用PCR技术从葡萄叶片总DNA中扩增出RS基因全长,然后将其重组到克隆载体中。通过酶切对重组质粒进行了鉴定和测序,结果表明,RS基因已经正确克隆至pUC19中,将重组质粒转入大肠杆菌里,使RS基因能够在大肠杆菌里保存并且大量扩增,为RS基因构建表达载体表达白藜芦醇合成酶奠定了基础。     

构建定向T载体用于基因克隆和表达

传统的T载体克隆方法需要烦琐的后续步骤来筛选和鉴定重组子,并且无法实现目的基因的定向克隆。为了克服这些问题,本研究在pET-23a(+)的基础上构建了定向T载体pETG,首先通过定点诱变消除pET-23a(+)上的两个BfuⅠ位点得到PET-23aM;设计一对引物在5端各引入一个BfuⅠ位点,下游引物紧邻BfuⅠ位点引入13 bp的部分LacO序列,用该引物从pHBM2002上扩增Prrn-gfp表达盒,插入PET-23aM的NdeⅠ和XhoⅠ位点,得到定向T载体pETG。PCR扩增的目的基因通过下游引物引入7 bp剩余的LacO序列,该基因片段与BfuⅠ酶切制备的定向T载体连接、转化大肠杆菌DH10β感受态细胞,通过补加了X-gal的平板筛选蓝色重组子。质粒酶切和PCR鉴定表明蓝色菌落全部为定向插入的重组子,重组效率100%,利用本方法成功地定向克隆了103个人类肝蛋白编码基因cDNA,克隆过程无需复杂的步骤筛选鉴定重组子。随机选择了其中的8个基因的克隆进行表达,结果显示8个克隆均在大肠杆菌中获得成功表达。该结果表明定向T载体构建成功,并且该载体非常适合基因的克隆和表达。     

来源于Bacillus subtilis的中性植酸酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

通过PCR的方法从Bacillus subtilis基因组中克隆了中性植酸酶基因nphy,DNA全序列分析表明其结构基因全长1152个核苷酸(编码383个氨基酸),5′端有一编码26个氨基酸的信号肽序列。去除信号肽编码序列的nphy克隆到大肠杆菌IPTG诱导表达载体pTYB40上,在大肠杆菌中得到了高效表达,表达量达到大肠杆菌可溶性蛋白的40%以上,表达产物具有生物学活性,证实了克隆到的中性植酸酶的编码基因有正常的生物学功能。     

兔IFRG基因的克隆及表达分析

实验通过对兔子基因组DNA进行PCR获得兔IFRG基因,将其克隆到pGEM-T载体,双酶切鉴定和测序结果表明成功构建了重组克隆载体pGEM-T-IFRG。通过RT-PCR分析发现IFRG基因在兔不同组织中有不同程度的表达。将重组克隆载体pGEM-T-IFRG和表达载体pET-41（c）经过EcoR1和Xho1双酶切后连接构建重组表达载体pET-41（c）-IFRG,将双酶切鉴定正确的重组表达载体转化入E.coli BL21,IPTG诱导融合蛋白的表达,SDS-PAGE结果显示兔IFRG基因在大肠杆菌中得到了良好的表达。     

人成骨蛋白-1成熟肽基因在大肠杆菌中的克隆与表达

本实验报告了人成骨蛋白 - 1成熟肽基因在大肠杆菌中的克隆与高效表达。通过计算机软件分析 ,采用大肠杆菌偏爱密码子设计并分段合成了人成骨蛋白 - 1成熟肽编码基因片段。用 PCR技术扩增目的基因片段 ,先克隆到 p UC1 9载体上 ,测序正确后再将其克隆到 p BV2 2 0表达载体上 ,以DH5α为宿主菌 ,42℃ ,6 h诱导表达。经 SDS- PAGE鉴定分析 ,在约 1 6× 1 0 3处有一新的蛋白质条带 ,扫描分析表明 ,该条带占菌体总蛋白含量的 40 %左右。     

甘蔗黄叶病毒外壳蛋白基因原核表达研究

本研究主要目的是构建ScYLV-CP基因的原核表达载体,表达ScYLV-CP蛋白。采用PCR扩增出CP基因的蛋白编码序列,克隆到中间载体中,再经双酶切、亚克隆到表达载体中,构建该基因的表达载体pET-29 a-CP,在大肠杆菌中用IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳。酶切鉴定表明表达载体内插入片段正确,在大肠杆菌中诱导后,出现一条分子量约为22 kDa蛋白带,与CP基因开放阅读框架的理论推算值21.719 kDa相符。研究表明甘蔗黄叶病毒外壳蛋白能在原核细胞中高效表达,为建立甘蔗黄叶病毒血清学快速检测技术奠定基础。     

蜜蜂螺原体细胞骨架相关基因mreB的克隆表达及在螺原体二种形态时的表达差异

【目的】在大肠杆菌中克隆表达蜜蜂螺原体细胞骨架相关基因mreB1?5,并预测所编码蛋白的理化性质,分析这些基因在螺原体螺旋状和非螺旋状时的表达水平,为进一步分析该基因的功能奠定基础。【方法】通过PCR扩增,从Spiroplasma melliferum CH-1基因组中获得mreB1?5基因,构建的重组表达载体pETmreB1?5分别在大肠杆菌BL21中诱导表达,利用镍亲和树脂纯化重组蛋白,通过在线工具预测MreB蛋白质的理化性质和功能域。利用Real-Time PCR比较螺原体CH-1在两种不同形态时mreB1?5基因的表达量。【结果】成功克隆到5个mreB基因,并在大肠杆菌BL21中高效表达。MreB蛋白分子量分别为36、23、23、37和25 kD,可能均为疏水性的蛋白,属于MreB/Mbl蛋白质家族。荧光定量PCR结果显示,螺原体在非螺旋状时mreB1?5基因的表达水平均远低于在螺旋状时基因的表达水平。【结论】本文第一次克隆表达了螺原体细胞骨架相关基因mreB1?5,初步表明这些基因在螺原体形态方面可能具有重要作用,为后续研究螺原体mreB基因在其运动和形态方面的功能提供了重要信息。     

调控蛋白CRP和FNR对青霉素G酰化酶基因表达的影响

青霉素G酰化酶的表达受多种因素的调控。利用crp和fnr基因缺陷型菌株研究了葡萄糖阻遏和氧调控的机制。结果表明：FNR对pac表达不起调控作用,CRP对pac基因表达有正调控作用．并且CRP的结合位点位于结构基因上游的DNA序列上。随后,测定结构基因上游调控区的DNA序列,发现可能的CRP蛋白结合位点的同源保守序列为TGTGA。     

Isolation of recombinant plasmids and phage carrying the lexA gene of Escherichia coli K-12

The lexA gene of Escherichia coli K-12 was cloned from the plasmid pLC44-14 into pBR322. Plasmids carrying lexA+ were selected by their ability to complement a recessive tsl mutation, which is believed to be a mutation in lexA. The smallest lexA+ recombinant plasmid, pJL21, contained an EcoRI-PstI fragment 2.9 kilobases (kb) in length; two larger plasmids also contained this fragment, and genetic material to one or both sides of the EcoRI-PstI fragment. Plasmids homologous to pJL21, but carrying a dominant mutation, lexA3, or one of three recessive amber mutations in lexA, termed spr, were also isolated. To clone the EcoRI-PstI fragment onto a lambda vector, the PstI end was first converted to an EcoRI end by attachment of a 100-base pair PstI-EcoRI fragment isolated from the plasmid ColE1; the resultant EcoRI fragment was then cloned into the lambda vector lambda gt4. A restriction map of pLC44-14 was obtained for nine restriction enzymes. The orientation of this map was determined relative to the E. coli genetic map by complementation of the gene ubiA+ and by comparison with restriction enzyme digests of another plasmid, pLC11-9, which carries dnaB, a gene closely linked to lexA, but does not carry lexA.     

中华眼镜蛇短链神经毒素cDNA的克隆及在大肠杆菌中的表达

利用RT－PCR技术从中华眼镜蛇毒腺组织中成功地克隆了短链神经毒素CDNA。测序结果表明,该基因开放阅读框架编码83个氨基酸残基,其中对个为信号肽,成熟肽为62个氨基酸残基。该基因与GenBank报道的相同物种的神经毒素基因有相当的同源性,不同物种之间的信号肽序列十分保守。将短链神经毒素CDNA再经PCR扩增除去信号肽序列,克隆到pT7ZZ表达质粒中,转化E.coliBL21（DE3）后,经IPTG诱导可高效表达分子量为23kDa②左右的融合蛋白。表达产物占菌体总蛋白的25％左右。     

Expression of human c-raf-1 oncogene proteins in E. coli

Full length and truncated versions of the human c-raf-1 cDNA were cloned into the inducible E. coli expression vector pJL6. C-raf proteins of 73 kD, 57 kD and 39 kD were produced upon induction. p73 differs from normal p73 c-raf by deletion of the two first N-terminal amino acids and their replacement by 16 amino acids encoded by the vector. The p57 and p39 represent N-terminal deletions which leave the transforming protein kinase domain intact. These proteins could be readily purified from E. coli lysates by immunoprecipitation with raf-specific antisera.     

大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶基因的克隆与真核表达载体的构建

根据Ｇｅｎｂａｎｋ中大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶（ＰＮＰ）基因的核苷酸序列,设计并合成了一对引物,以大肠杆菌基因组ＤＮＡ为模板,进行ＰＣＲ扩增,并将扩增产物定向连接到克隆、测序及真核表达载体ＰＣＤＮＡ３中,进行酶切鉴定、测序及序列分析。结果表明ＰＣＲ扩增出７４１ｂｐ大小的片段,通过酶切和序列分析证明含完整的ＰＮＰ基因序列且基因插入方向正确,此序列与文献报道的ＰＮＰ基因的同源性为９９．７％。说明克隆的ＰＮＰ基因与文献报道的基本一致,ｐｃＤＮＡ３－ＰＮＰ的构建成功为今后用其进行基因转染来研究ＰＮＰ／Ｍｅｐ－ｄＲ自杀基因系统在肿瘤基因治疗中的应用打下了基础。     

富含蛋氨酸玉米醇溶蛋白在大肠杆菌中的表达

目的:克隆玉米中富含蛋氨酸的10kD玉米醇溶蛋白,证明植物源目的基因在大肠杆菌中能够表达.方法:从玉米胚乳中克隆高蛋氨酸基因zein,通过PCR扩增zein片段,连接pGEX - 4T -1原核表达载体,转入大肠杆菌中,IPTG诱导后,HPLC测定蛋氨酸含量.结果:经PCR扩增出467bp条带,Blast分析同源性99%,经IPTG诱导进行SDS - PAGE检测,发现在36kD处出现一条明显的条带.诱导后菌体总蛋氨酸含量比正常菌体提高了9.6%.结论:证实了植物源10kD玉米醇溶蛋白在大肠杆菌中能够表达.     

限制修饰系统cglI赋予钝齿棒杆菌抗噬菌体功能活性

为解决氨基酸发酵工业中的噬菌体污染问题, 对cglI基因复合体在钝齿棒杆菌中的功能活性表达进行研究。通过PCR从谷氨酸棒杆菌基因组扩增cglI基因复合体, 构建重组质粒pJL23-cglI, 转化钝齿棒杆菌T6-13后得到重组菌株。定性和定量检测重组菌株的噬菌体抗性。实验结果表明, 携带cglI基因复合体的重组钝齿棒杆菌显示了明显的抗噬菌体功能活性和较广的抗噬菌体谱, 进而证实了cglI基因复合体用于构建钝齿棒杆菌抗噬菌体菌株的可行性, 为解决氨基酸发酵生产中的噬菌体污染问题提供了一种有效方法。     

限制修饰系统cglI赋予钝齿棒杆菌抗噬菌体功能活性

为解决氨基酸发酵工业中的噬菌体污染问题, 对cglI基因复合体在钝齿棒杆菌中的功能活性表达进行研究。通过PCR从谷氨酸棒杆菌基因组扩增cglI基因复合体, 构建重组质粒pJL23-cglI, 转化钝齿棒杆菌T6-13后得到重组菌株。定性和定量检测重组菌株的噬菌体抗性。实验结果表明, 携带cglI基因复合体的重组钝齿棒杆菌显示了明显的抗噬菌体功能活性和较广的抗噬菌体谱, 进而证实了cglI基因复合体用于构建钝齿棒杆菌抗噬菌体菌株的可行性, 为解决氨基酸发酵生产中的噬菌体污染问题提供了一种有效方法。     

乙型肝炎病毒S基因与截短C基因融合的穿梭表达载体的构建

研究目的是构建HBVS基因和截短C基因融合的胞壁型和分泌型大肠杆菌和分枝杆菌(E．coli-BCG)穿梭质粒。采用PCR方法从结核分枝杆菌MTB毒株H37Rv的基因中扩增出相对分子质量为19000的抗原胞壁区及其上游调控元件基因,克隆入穿梭载体pOLYG中。以含HBV基因组的质粒pCP10序列为模板,PCR扩增获得5基因片段Sw和C基因编码氨基端的部分基因片段Ct,克隆入胞壁型穿梭表达载体pCW和分泌型穿梭表达载体pDE22。经酶切和序列测定证实,胞壁型和分泌型载体pCW-Sw-Ct和pDE22-Sw-Ct构建成功。为进一步研究含S基因和截短C基因融合的重组BCG活疫苗奠定了基础。     

抗冻蛋白结构基因片段的克隆

为了研究和开发利用抗冻蛋白或多肽,木文通过聚合酶链式反应（ＰＣＲ）合成了抗冻蛋白１１０ｂｐ的结构基因片段,然后将该基因片段克隆到大肠杆菌质粒载体Ｐ（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）Ⅱｋｓ＋／－上,获得了重组质粒,经酶切证明,获得的重组质粒中含有抗冻蛋白结构基因片段,以供该基因在大肠杆菌或酵母中表达抗冻蛋白。