CglI基因在大肠杆菌中的功能活性分析

通过PCR技术从谷氨酸棒杆菌基因组中扩增CglI基因,克隆到载体pMD18-T Simple后测序。将CglI基因亚克隆到表达载体pJL23,构建重组质粒pJL23-CglI,转化大肠杆菌HB101菌株,通过PCR反应筛选鉴定阳性克隆。通过噬菌体感染实验,初步分析了CglI基因在大肠杆菌中的功能活性。     

构建定向T载体用于基因克隆和表达

传统的T载体克隆方法需要烦琐的后续步骤来筛选和鉴定重组子,并且无法实现目的基因的定向克隆。为了克服这些问题,本研究在pET-23a(+)的基础上构建了定向T载体pETG,首先通过定点诱变消除pET-23a(+)上的两个BfuⅠ位点得到PET-23aM;设计一对引物在5端各引入一个BfuⅠ位点,下游引物紧邻BfuⅠ位点引入13 bp的部分LacO序列,用该引物从pHBM2002上扩增Prrn-gfp表达盒,插入PET-23aM的NdeⅠ和XhoⅠ位点,得到定向T载体pETG。PCR扩增的目的基因通过下游引物引入7 bp剩余的LacO序列,该基因片段与BfuⅠ酶切制备的定向T载体连接、转化大肠杆菌DH10β感受态细胞,通过补加了X-gal的平板筛选蓝色重组子。质粒酶切和PCR鉴定表明蓝色菌落全部为定向插入的重组子,重组效率100%,利用本方法成功地定向克隆了103个人类肝蛋白编码基因cDNA,克隆过程无需复杂的步骤筛选鉴定重组子。随机选择了其中的8个基因的克隆进行表达,结果显示8个克隆均在大肠杆菌中获得成功表达。该结果表明定向T载体构建成功,并且该载体非常适合基因的克隆和表达。     

大肠杆菌ubiC基因的克隆及序列分析

研究以克隆得到正确序列的大肠杆菌ubiC基因目的,实验通过PCR方法从大肠杆菌基因组中扩增得到了ubiC基因,扩增产物克隆到pUC118载体,转化大肠杆菌JM109,DNA序列分析结果表明克隆得到的大肠杆菌ubiC基因碱基序列正确。     

木糖异构酶基因xylA的克隆及其表达载体的构建

木糖异构酶基因xylA是一种正向选择标记基因,在植物基因工程中使用该标记可以获得安全的转基因植物.构建了以xylA基因为选择标记的植物表达载体.从大肠杆菌Top10中扩增出xylA基因,插入到质粒pCAMBIA2301的Xho Ⅰ位点,通过酶切和PCR检测插入片段的正确性,得到载体pCAMBIA2301-xylA,将pBI121载体上的‘35S-GUS-Nos'表达框插入到pCAMBIA2301-xylA的EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ位点.得到中间载体pCAMBIA2301-xylA-GUS,用Sac Ⅰ和Sma Ⅰ切下克隆载体上的CBF1基因替代pCAMBIA2301-xylA-GUS中的GUS片段,用电转化法将获得的表达载体转化到农杆菌中,为将来获得安全的转基因抗寒植株奠定基础.     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌flic基因的原核表达与生物学活性分析

以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清Ⅰ型菌株基因组为模板,根据其鞭毛区与其它细菌高度同源性设计引物,利用PCR方法扩增鞭毛蛋白基因flic片段,将其亚克隆到pMD-18T载体中并进行PCR和酶切鉴定,再将其亚克隆与载体pGEX-kG分别双酶切和连接,构建重组表达载体pGEX-flic,并将其转化大肠杆菌工程菌BL21进行原核表达.结果表明,目的基因片段长度为528 bp,在大肠杆菌BL21中获得成功表达,且表达蛋白能与猪抗APP血清发生反应.为进一步研究细菌鞭毛的抗原性及其他功能提供参考.     

葡萄白藜芦醇合成酶基因的克隆

为了构建白藜芦醇合成酶(RS)基因的克隆载体,用PCR技术从葡萄叶片总DNA中扩增出RS基因全长,然后将其重组到克隆载体中。通过酶切对重组质粒进行了鉴定和测序,结果表明,RS基因已经正确克隆至pUC19中,将重组质粒转入大肠杆菌里,使RS基因能够在大肠杆菌里保存并且大量扩增,为RS基因构建表达载体表达白藜芦醇合成酶奠定了基础。     

猪A组轮状病毒Vp6基因与乳酸菌非抗性表达载体的重组及在大肠杆菌中的表达

以猪A组轮状病毒mRNA为模板,应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,扩增了1194bp的Vp6基因,通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至克隆载体pGEM-TVector中,构建克隆质粒pGEM-T-Vp6。用SacⅠ和KpnⅠ双酶切pGEM-T-Vp6和以胸苷酸合成酶基因(thymidylate synthase,thyA)为选择压力的非抗生素抗性的穿梭表达载体pW425t,并将纯化的Vp6基因亚克隆至表达载体pW425t中,构建出可以在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达的原核表达重组质粒pW425t-Vp6。将pW425t-Vp6转化至thyA基因缺陷型的大肠杆菌感受态E.coliX13中,经生长功能弥补筛选阳性克隆,通过SDS-PAGE分析,可见约44.88kD的融合蛋白。由Western blot分析,表明该蛋白具有与轮状病毒多克隆抗体的反应原性,从而为pW425t-Vp6在乳酸菌受体菌株中表达提供理论基础和实验依据。     

一种快速高效的基于CcdB致死基因和SmaⅠ酶切位点的克隆体系构建

PCR片段快速准确的构建到克隆载体是分子生物学实验的关键技术之一。快速高效低背景克隆体系的建立可以显著提高PCR产物的克隆效率及大大缩短克隆时间。本实验室开发出一种在常规条件下进行快速高效PCR连接的克隆体系。本研究将含有ccd B致死基因的gateway cassette片段,插入p UC18载体,成功构建p UC18-Ccd B致死载体,在此基础上结合ccd B致死基因内部的SmaⅠ酶切位点,开发出将PCR产物、SmaⅠ限制性内切酶、T4连接酶及p UC18-Ccd B致死载体一起加入离心管后共孵育10 min,即可转化大肠杆菌。对插入片段的重组质粒进行了酶切,PCR和测序验证,证实了该克隆体系高效可行,具有极高的阳性克隆率。该体系的建立具有高效低背景的特点,并且极大的减少了克隆步骤,省去了胶回收及双酶切过程,缩短了克隆时间,同时继承了p UC18载体的优点,具有很强的应用性及推广性。     

兔IFRG基因的克隆及表达分析

实验通过对兔子基因组DNA进行PCR获得兔IFRG基因,将其克隆到pGEM-T载体,双酶切鉴定和测序结果表明成功构建了重组克隆载体pGEM-T-IFRG。通过RT-PCR分析发现IFRG基因在兔不同组织中有不同程度的表达。将重组克隆载体pGEM-T-IFRG和表达载体pET-41（c）经过EcoR1和Xho1双酶切后连接构建重组表达载体pET-41（c）-IFRG,将双酶切鉴定正确的重组表达载体转化入E.coli BL21,IPTG诱导融合蛋白的表达,SDS-PAGE结果显示兔IFRG基因在大肠杆菌中得到了良好的表达。     

蛇毒金属蛋白酶Alfimeprase在大肠杆菌中的表达、纯化及活性检测

目的:应用大肠杆菌表达系统表达纤溶性蛇毒金属蛋白酶Alfimeprase。方法:运用PCR技术扩增人工合成的目的基因,引入Nde Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切位点;目的基因经Nde Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切后,克隆到pET22b载体上,然后将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行胞内表达,对获得的包涵体进行体外透析复性;应用纤维蛋白原水解法、纤维蛋白平板法和纤维蛋白层叠法检测复性后蛋白的降纤活性。结果:目的蛋白以包涵体形式在大肠杆菌中获得高表达,复性后的蛋白具有降解纤维蛋白(原)的活性。结论:Alfimeprase包涵体可以通过复性获得活性产物。     

酵母表面展示T载体构建及目的蛋白的表面展示

构建一种能对PCR产物进行直接克隆并展示于酵母表面的新型T载体。根据酵母表面展示载体p YD1多克隆位点序列设计出利用两端带有XcmⅠ内切酶酶切位点的含有黄色荧光蛋白基因的XcmⅠ酶切盒,通过NheⅠ和XhoⅠ酶切位点插入到p YD1载体上形成质粒p YD-YFP,并对其进行酶切鉴定和DNA测序分析,再经XcmⅠ酶切后形成两端带有d T的表面展示T载体。利用PCR扩增两个含有荧光蛋白的融合蛋白PCAD-CFP和PSR-Ds Red的基因并直接克隆到所构建的T载体中,检测其表达功能。酶切鉴定和DNA测序结果显示PCAD-CFP和PSR-Ds Red正确插入载体上,分别转化至酿酒酵母EBY100中,激光共聚焦显微镜下观察到相应的荧光的酵母,表明克隆有融合蛋白基因片段的载体成功在酵母细胞中进行表面展示,证明了所构建的酵母表面展示T载体具有直接克隆和表面展示目的蛋白的功能。     

用于丝状真菌的苯菌灵标记基因benA表达载体的构建

为了构建适用于丝状真菌遗传转化的表达载体,在质粒pAN52-1的高效组成型三磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子PgpdA和色氨酸C基因终止子TtrpC之间加入内切酶NotⅠ和ClaⅠ两个位点,构成质粒pAN52-2;把质粒pAN52-2中从启动子PgpdA到终止子TtrpC的基因片段通过PstⅠ和XbaⅠ酶切位点导入到pUC19载体上,并且应用PCR的方法在启动子Pg-pdA的前端引入HindⅢ酶切位点,构成质粒pUCPT-2;通过PCR,在苯菌灵抗性基因benA两端分别加入内切酶NotⅠ和ClaⅠ酶切位点,并克隆到pGEM-T载体上,得到质粒pGEM-Ben;用NotⅠ分别酶切质粒pUCPT-2与pGEM-Ben,连接苯菌灵抗性基因benA到pUCPT-2上,得到了pUCPT-Ben载体。经PCR、酶切和核苷酸序列检测,证实了PgpdA-benA-TtrpC表达元件连接成功,即得到了苯菌灵抗性基因高效表达载体。     

抗伏马菌素单链抗体与碱性磷酸酶的融合表达及活性鉴定

为原核表达抗伏马菌素单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白并分析其活性,本研究根据抗伏马菌素单链抗体H2的基因序列设计引物,PCR扩增获得目的基因,经限制性核酸内切酶SfiⅠ和Not Ⅰ的酶切位点克隆到pDAP2/S载体中,转化大肠杆菌(Eschrichia coli)菌株XL1-Blue并鉴定阳性转化子.IPTG诱导H2-AP融合蛋白基因的表达,利用Western blot检测其表达情况,AP显色反应和ELISA鉴定其活性.结果显示成功构建了 pDAP2/S-H2原核表达载体,融合蛋白在大肠杆菌中实现可溶性表达,并保留单链抗体和碱性磷酸酶的活性.因此,H2-AP融合蛋白通过原核表达后可用于发展伏马菌素的快速免疫检测方法.     

家蝇伴侣蛋白TCP-1基因的序列分析、克隆及诱导表达

旨在对EST筛选得到的家蝇伴侣蛋白TCP-1(MD-TCPⅠ)基因进行序列分析,克隆其cDNA序列并在大肠杆菌中诱导表达。采用EST测序技术从已构建的家蝇幼虫cDNA质粒文库中筛选到MD-TCPⅠ基因,对其进行序列测定和分析。以该基因的cDNA文库质粒为模板,通过PCR的方法进行扩增,以pET-28a(+)为载体构建重组质粒,再转化到表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。表达产物通过SDS-PAGE进行鉴定。结果显示,MD-TCPⅠ基因ORF全长753 bp,编码250个氨基酸,理论分子量27.07 kD;等电点5.92,该序列编码的蛋白属于热休克蛋白60家族的TCP。构建了正确基因序列MD-TCPⅠ重组表达质粒,重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。     

来源于Bacillus subtilis的中性植酸酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

通过PCR的方法从Bacillus subtilis基因组中克隆了中性植酸酶基因nphy,DNA全序列分析表明其结构基因全长1152个核苷酸(编码383个氨基酸),5′端有一编码26个氨基酸的信号肽序列。去除信号肽编码序列的nphy克隆到大肠杆菌IPTG诱导表达载体pTYB40上,在大肠杆菌中得到了高效表达,表达量达到大肠杆菌可溶性蛋白的40%以上,表达产物具有生物学活性,证实了克隆到的中性植酸酶的编码基因有正常的生物学功能。     

大豆fad基因反义表达载体构建及转化烟草研究

使用PCR方法从大豆基因组DNA中扩增出大豆油酸脱饱和酶基因fad2-1,连接到pMD18-T载体中,转化大肠杆菌JM109菌株.测序后,用DNAstar软件进行同源性比对.然后将正确的序列反向克隆到表达载体pBt,并转化农杆菌菌株LBA4404,经双酶切鉴定和PCR扩增检测,获得具有该基因反向序列的农杆菌工程菌,转化...     

大白菜抗软腐病基因BrWRKY33植物表达载体的构建

利用农杆菌侵染法获得抗软腐病转BrWRKY33基因大白菜,首先要构建植物表达载体。本实验根据BrWRKY33基因的序列及pROK2表达载体的酶切位点设计引物(FN/RN),获得BrWRKY33基因,然后将该基因连接到克隆载体pGEM-TEasy,重新构建了克隆载体T-WRKY。经测序及酶切验证,选取PCR反应中错配率最低的产物,构建了表达载体pROK2-WRKY,并将该表达载体转入到根癌农杆菌EHA105中,并对其转化子进行了鉴定。结果表明,PCR扩增获得目的基因BrWRKY33全长约1443bp,PCR及酶切结果鉴定表明克隆载体T-WRKY已经重新构建成功。表达载体的PCR及BamHⅠ和KpnⅠ双酶切鉴定表明有4个重组子表现阳性,表明目的基因已经插入到pROK2表达载体,表达载体构建成功。PCR鉴定表明表达载体pROK2-WRKY已经转入根癌农杆菌EHA105中。本实验结果将为进一步研究大白菜抗软腐病基因的转化奠定基础。     

肺炎支原体P1粘附蛋白基因的克隆

目的 在大肠杆菌中克隆含肺炎支原体P1粘附蛋白基因的重组质粒,为实现肺炎支原体P1粘附蛋白基因的大量扩增及表达奠定基础。方法 通过PCR方法获取肺炎原体P1粘附蛋白基因,用限制性核酸内酶EcoR Ⅰ切割后与pUC19载体DNA连接,转入大肠杆菌JM109菌株。用X－gal平板筛选转化子,应用P1基因区特异重复序列(RepMP2/3）引物对重组质粒进行PCR扩增和限制性核酸内酶切图谱分析鉴定。结果 PCR和限制性核酸内切酶图谱分析均证实所获重组质粒中含有P1粘附蛋白基因。结论 获得含有肺炎支原体P1粘附蛋白基因的重组克隆。     

家蝇抗菌肽Defensin基因同向串联表达载体的构建和鉴定

目的:构建家蝇抗菌肽Defensin基因多拷贝串联体,并克隆到甲醇酵母分泌表达载体pPIC9K上。方法:PCR法扩增家蝇抗菌肽Defensin基因成熟肽片断,目的片断的上游5′端带有EcoRⅠ和NheⅠ位点,下游5′端带有NotⅠ和XbaⅠ位点,目的片断首先克隆入pMD18-T载体,利用pMD18-T载体的NdeⅠ位点和目的片断上的一对同尾酶(NheⅠ和XbaⅠ),多次酶切连接,串联成多拷贝的Defensin成熟肽基因,再用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切,最后克隆入甲醇酵母分泌表达载体pPIC9K。结果:PCR鉴定、酶切鉴定和DNA测序证明多拷贝基因重组质粒构建成功。结论:该方法能方便高效地获得所需的多拷贝基因,为进一步进行高效表达打下基础。