植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体构建及表达

旨在构建植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体,并进行初步表达。以重组克隆质粒pMD18-T-Imp为模板,PCR扩增Imp基因片段。构建表达载体pET-28a(+)-Imp,转化宿主菌E.coliBL21(DE3)。筛选阳性克隆,提取重组质粒作PCR鉴定、酶切鉴定及IPTG诱导表达鉴定。PCR及双酶切结果显示,重组质粒pET-28a(+)-Imp构建成功。经IPTG诱导BL21(pET-28a(+)-Imp)表达约20 kD的蛋白,与预期的携带6×His-Tag的目的蛋白(19.5 kD)大小相符,主要以包涵体形式存在。结果显示,构建的表达载体pET-28a(+)-Imp在E.coliBL21(DE3)中能够达一定量表达,为进一步纯化Imp蛋白奠定基础。     

δ-睡眠肽与GFP融合蛋白的表达和纯化

构建δ-睡眠肽(DSIP)蛋白与GFP的融合基因表达载体,高效表达和纯化GFP-DSIP融合蛋白。通过SOE-PCR拼接DSIP全长编码基因,并使得DSIP上游具有肠激酶识别位点,经双酶切定向克隆至表达载体pET-28a,构建重组载体pET-28a-DSIP,通过PCR扩增GFP全长编码基因,经双酶切定向克隆至pET-28a-DSIP,构建原核重组表达载体pET-28a-GFP-DSIP,通过双酶切和测序鉴定后,导入E.coli BL21宿主菌中,IPTG诱导表达融合蛋白,采用镍亲和层析和分子筛凝胶层析获得高纯度蛋白,SDS-PAGE分析鉴定。经测序鉴定成功构建了原核重组表达载体pET-28a-GFP-DSIP,在IPTG诱导下获得可溶性的绿色荧光蛋白与睡眠肽的融合蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化成功获得高纯度的融合蛋白。成功构建了DSIP与GFP融合基因的重组表达载体,确定了GFP-DSIP融合蛋白诱导表达的最佳条件,获得了较高纯度的融合蛋白,为进一步研究DSIP蛋白的生物学功能奠定了基础。     

人脂联素重组克隆载体构建

目的：构建含有人脂联素（adiponectin,ad）基因的重组克隆载体pEGFP-N1-AD,为进一步研究AD与脂质代谢及代谢综合征关系奠定基础。方法：根据Gene-Bank中已经公布的AD设计引物,从含有目的基因的质粒克隆模板中,利用PCR方法钓取目的基因。将AD基因克隆到真核表达载体pEGFP-N1中。酶切、PCR、及测序鉴定。结果：PCR、酶切及测序鉴定证实目的基因正确克隆至真核表达载体pEGFP-N1中,测序结果与Gene—Bank报道一致。结论：成功构建了AD重组克隆真核表达载体。     

结核分枝杆菌furA基因真核表达质粒的构建及表达

以BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切pRSET-furA,获得结核分枝杆苗铁调控基因furA,将其克隆入真核表达载体pcDNA3．1（-）,构建了重组质粒pcDNA-furA,经酶切鉴定正确后,将重组质粒以阳离子聚合物转染CHO细胞。经RT—PCR分析表明,furA可在CHO细胞中转录;用间接免疫荧光检测,表达有FurA蛋白的细胞着染。以上结果表明,通过构建结核分枝杆菌furA基因的真核表达载体pcDNA-furA,使知以基因可以在CHO细胞中表达。     

人核糖核酸酶抑制因子基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建含有人核糖核酸酶抑制因子（hRI）基因的重组腺病毒载体。方法以含有全长cDNA的pT7-RI为模板,PCR扩增hRI,经T载体克隆后,酶切亚克隆到穿梭质粒pAdTrack—CMV上,在BJ5183细菌内和pAdEasy-1同源重组。筛选阳性克隆,酶切、PCR及测序鉴定,线性化后脂质体法转染293细胞进行包装、扩增。通过观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒。结果酶切鉴定及PCR结果证明hRI基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度为1．5×10^10 pfu/ml。结论应用细菌内同源重组法成功构建了含hRI基因的重组腺病毒载体。     

恶性疟原虫乳酸脱氢酶基因的克隆表达及表达产物免疫原性的鉴定

目的：克隆表达恶性疟原虫（Hasmodium falciparum,p．f）海南株（FCC1／HN）乳酸脱氢酶（LDH）,并对其免疫原性进行鉴定．为制备抗LDH抗体用于胶体金法快速检测疟原虫奠定基础。方法：应用PCR技术对恶性疟原虫乳酸脱氢酶（LDHpf）基因进行特异性扩增,将扩增产物克隆入表达载体pET-32a（＋）,重组表达载体经鉴定后诱导表达;重组LDHpf（rLDHpf）经纯化后,免疫家兔制备兔抗rLDHpf免疫血清,间接免疫荧光和Western印迹鉴定表达产物的免疫原性。结果：构建了pET-32a／LDHpf重组表达载体,测序后同源性分析显示p．f不同株间LDH氨基酸序列同源性大于98％,不同种间同源性也在90％以上;间接免疫荧光和Western印迹分析显示rLDHpf具有较好的免疫原性。结论：LDHpf基因高度保守;rLDHpf得到高效表达并具有良好的免疫原性。     

决明胰蛋白酶抑制剂基因的克隆及其原核表达载体构建

[目的]克隆决明胰蛋白酶抑制剂全长cDNA序列,并构建原核表达载体。[方法]从决明种子中提取胰蛋白酶抑制剂总RNA,通过RT-PCR得到胰蛋白酶抑制剂cDNA,纯化后与PMD19-T载体连接,转化至大肠杆菌DH5α,获得了决明胰蛋白酶抑制剂基因的全长序列,并将该序列克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-28a(+)/COTI。[结果]决明胰蛋白酶抑制剂基因核苷酸长度为630bp,编码一条长度为209个氨基酸的多肽。决明胰蛋白酶抑制剂与不同植物来源的Kunitz蛋白酶抑制剂有高度的同源性,表明其属于Kunitz蛋白酶抑制剂家族成员。所获重组质粒pET-28a(+)/COTI经过双酶切鉴定,其含有目的片段,且重组质粒构建正确。[结论]克隆了决明胰蛋白酶抑制剂的全长cDNA序列,并成功构建了含有该基因的原核表达载体,这为该基因的进一步表达及功能鉴定奠定了基础。     

小鼠survivin基因重组真核表达载体的构建及鉴定

目的：应用质粒pEGFP-N1构建含小鼠survivin基因的重组真核载体。方法：采用Oligo核酸软件对Genbank上所发表的小鼠survivin mRNA序列进行分析,自行设计一对分别含有HindⅢ、BamHⅠ酶切位点的survivin基因上下游引物,利用PCR扩增出该基因的全序列cDNA,并将其定向克隆入pEGFP-N1的多克隆位点,构建pEGFP-N1/survivin重组真核表达载体。然后通过卡那霉素抗性筛选、双酶切及PCR鉴定,选取鉴定正确的克隆测序。结果：双酶切与测序结果表明目的基因序列克隆正确,成功构建了含有小鼠survivin基因的重组真核表达载体。结论：重组真核表达载体pEGFP-N1/survivin构建成功,为下一步研究sur-vivin在未成熟树突状细胞中诱导分化与致耐受作用奠定基础。     

兔早期胚胎发育相关新基因IFRG的克隆和表达

近来的研究表明干扰素在哺乳动物早期胚胎发育中有重要的作用。我们首次克隆了兔早期胚胎发育相关新基因IFRG（干扰素应答基因）的全长cDNA序列（AJ584672）,根据该cDNA序列以兔卵巢cDNA为模板经PCR扩增后克隆了兔IFRG cDNA的完整开放阅读框(396bp)。将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-2上,在大肠杆菌BL21中进行了GST-IFRG融合蛋白的表达。 经IPTG诱导培养后,SDS-PAGE电泳检测结果显示在41kDa处有特异性表达蛋白,回收融合蛋白作为抗原免疫小鼠,制备多克隆抗体,通过Western杂交表明该融合蛋白具有生物免疫活性。     

促DNA修复多效蛋白诱导因子pprI逆转录病毒载体系统的构建及其鉴定

目的:为实现耐辐射球菌pprI基因在哺乳动物细胞中的稳定遗传与表达,构建重组逆转录病毒载体质粒pLXIN-pprI。方法:将目的基因pprI亚克隆经过双酶切后定向连接到pLXIN质粒上,构建逆转录病毒重组质粒pLXIN-pprI。将pLXIN-pprI转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,氨苄青霉素筛选后抽提获得重组质粒pLXIN-pprI,双酶切及DNA测序鉴定。结果:酶切鉴定及测序结果显示结果与预期相符,pprI基因成功插入pLXIN逆转录病毒载体中。结论:重组逆转录病毒载体质粒pLXIN-pprI构建成功,为实现耐辐射球菌pprI基因在哺乳动物细胞中的重组与表达奠定了基础。     

重组人胱抑素C的原核表达及鉴定

目的构建重组人胱抑素C（cystatinC,CysC）的原核高效表达质粒,诱导表达并纯化获得CysC重组蛋白。方法根据大肠埃希菌编码蛋白的特性设计CysC编码基因序列,人工合成目的基因克隆至pET-22b（＋）表达载体中,测序及酶切鉴定正确后诱导其在大肠埃希菌BL21中表达,所获得的包涵体蛋白经亲和层析纯化后采用SDS—PAGE及Western印迹鉴定。结果酶切结果证实构建的表达质粒结构正确;测序结果显示克隆的基因序列所编码的蛋白与GenBank中的CysC氨基酸序列相符;SDS-PAGE及Western印迹结果证实获得的重组CysC融合蛋白分子量约为16kD,经NP亲和层析纯化获得纯度大于90％的目的蛋白。结论建立了重组人CysC的原核高效表达系统并获得了CysC重组蛋白。     

沙门菌外膜蛋白D的原核表达及多克隆抗体制备

目的:在大肠杆菌中表达沙门菌外膜蛋白(OMP)D,纯化后制备兔抗OMPD抗体。方法:用PCR方法从鼠伤寒沙门菌中扩增出ompD基因,并插入融合表达载体pET-28a(+)的多克隆位点,构建重组表达质粒pET28a(+)-ompD;以重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选阳性重组菌株,经IPTG诱导目的蛋白表达,在变性条件下对目的蛋白进行亲和层析纯化;以表达的OMPD蛋白免疫家兔,制备抗OMPD的多克隆抗体并进行鉴定。结果:扩增了ompD基因,测序证实正确后亚克隆于表达载体pET-28a(+)中,经PCR筛选和酶切鉴定获得阳性克隆,经诱导在大肠杆菌中表达出相对分子质量为40×103的目的蛋白并进行纯化;纯化的OMPD免疫家兔后,能有效地刺激特异性抗体的产生,抗血清的效价达到1∶10000以上,且具有良好的特异性。结论:构建ompD基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;制备出兔抗OMPD抗体,效价及特异性均良好,为进一步制备肠黏膜高亲和力疫苗奠定了基础。     

胆汁三烯结合蛋白在大肠杆菌中的表达、复性与纯化

目的：合成胆汁三烯结合蛋白（BBP）基因并在大肠杆菌中表达,获得重组BBP纯化制品。方法：根据天然BBP的基因序列和大肠杆菌偏好密码子设计并合成BBP基因的引物,PCR扩增优化的BBP基因序列,克隆至载体pEasy-T3;测序正确后,将该序列克隆至表达载体pET-32a上,构建表达质粒,转化至大肠杆菌BL21（DE3）pLysS,在IPTG诱导下表达融合蛋白;采用Ni柱纯化融合蛋白。结果：PCR扩增获得了优化后的BBP基因序列,构建了表达载体pET-32a-BBP;SDS-PAGE分析表明表达的融合蛋白相对分子质量为20×10^3,以包涵体形式存在,占全菌蛋白的40%以上;变性、复性后经Ni2＋柱纯化,获得纯度达98%以上的重组蛋白。结论：优化并合成了BBP全基因序列,获得了高纯度重组融合蛋白,为进一步鉴定其生物活性及筛选小分子的研究奠定了基础。     

肠出血性大肠杆菌毒力因子Z1444的原核表达及其丝/苏氨酸激酶活性验证

目的:在大肠杆菌中表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)毒力岛上的毒力因子Z1444并纯化,对其丝/苏氨酸激酶活性进行初步检测。方法:根据GenBank中Z1444基因序列及pET-28a(+)载体的多克隆位点设计引物,以EHECO157∶H7全菌裂解液为模板,经PCR钓取1047 bp的目的片段,与表达载体pET-28a(+)连接,构建重组表达质粒pET-28a(+)-Z1444,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导蛋白表达并经SDS-PAGE鉴定,利用体外反应体系鉴定重组蛋白的丝/苏氨酸激酶活性。结果:双酶切和测序鉴定表明,pET-28a(+)-Z1444原核表达质粒构建正确;诱导表达后经纯化,获得纯度在90%以上的可溶性重组Z1444,相对分子量约为38×103;体外酶活实验验证了Z1444的丝/苏氨酸激酶活性。结论:Z1444在大肠杆菌中获得高效可溶性表达,为后续功能验证奠定了基础。     

中国旱獭β2m基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备

目的克隆、原核表达中国旱獭β2m基因,并制备多克隆抗体。方法利用RT—PCR技术从中国旱獭脾细胞中扩增β2m基因,克隆至pET28a（＋）质粒,构建原核表达载体pET-28a（＋）-CWβ2m,再转化宿主菌Rosetta（DE3）pLacI诱导其表达。使用切胶回收纯化目的蛋白,将纯化蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并采用酶联免疫吸附实验检测抗体的灵敏度和特异性。结果克隆出的中国旱獭β2m基因,与GenBank已公布的土拨鼠的碱基序列一致;Western印迹结果显示克隆的β2m基因能在大肠埃希菌中高效表达,免疫家兔获得了高效价的多克隆抗体。结论成功克隆了中国旱獭β2m基因,在原核宿主中进行了高效表达,获得的多克隆抗体具有较高的效价。为人工制备MHC-Ⅰ类分子复合物,深入研究嗜肝病毒感染过程中特异性CTL应答和效应机制奠定了基础。     

PHD2基因原核表达载体的构建及其在大肠埃希菌中的表达

目的构建PHD2基因原核表达载体pET-43.1b（＋）-PHD2,实现Nus-PHD2融合蛋白在大肠埃希菌中的可溶性表达。方法用SacⅠ酶切pET-43.1b（＋）制备线性化载体,设计与线性化载体两端具有至少15个同源序列的特异性引物,以真核重组质粒pCMV6-Entry-EGLN1为模板,PCR法扩增PHD2目的基因。采用In-Fusion技术构建原核表达载体pET-43.1b（＋）-PHD2,并将其导入大肠埃希菌BL21（DE3）中诱导表达。用SDS-PAGE和Western blot分析并鉴定表达出的融合蛋白。用Ni-NTA亲和层析法纯化目的蛋白。结果成功构建了PHD2原核表达载体;SDS-PAGE结果显示融合蛋白以可溶性形式表达;Western blot鉴定表明融合蛋白可以与PHD2单克隆抗体特异性结合。结论实现了Nus-PHD2融合蛋白在大肠埃希菌中的可溶性表达,为PHD2生物学功能的研究奠定了基础。     

嗜麦芽寡养单胞菌D2株单加氧酶基因的克隆与表达

构建嗜麦芽寡养单胞菌D2株荧光素样单加氧酶基因表达克隆载体,并进行融合表达。PCR扩增出嗜麦芽寡养单胞菌D2菌株基因组DNA中包含单加氧酶基因约1300bp的核酸片段,将其克隆到T载体pMD-18中进行序列测定,所得序列申请并获得GenBank登记号(GQ122330)。DNA star软件分析发现该基因片段中含有一个996bp的完整开放读码框架(ORF),与GenBank中收录的S.maltophilia R551-3(CP001111/GenomeProject17107)和K279a(AM743169)的MO基因核酸序列同源性分别为90%和89%,氨基酸序列同源性分别为93%和90%。根据该ORF序列设计分别含有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的表达克隆扩增引物,PCR扩增、双酶切后将产物亚克隆到pET32a载体中,经过双酶切验证,证实成功获得了表达重组载体pET32a/MO;将其转化宿主菌E.coli BL21,IPTG诱导后成功表达出54.2ku的MO融合蛋白,为该酶进一步的功能研究和开发奠定了基础。