嵌合型HCV全长cDNA的构建及体外转录制备感染性RNA的研究

构建HCV la/1b嵌合型全长cDNA克隆,进行体外转录,脂质体法转染HepG2细胞,以RT-PCR法检测HCV正、负链RNA,Western印迹检测HCV蛋白表达.结果表明,细胞在转染后8代(约35d)内,能间断检测到HCV正、负链RNA以及相对分子质量约70000的HCV NS3蛋白,证明该HCV嵌合体可以在细胞中复制和表达.本研究表明含有该嵌合型全长cDNA的质粒可以为后续HCV的研究提供大量可重复的性质均一的病毒模板,有助于深入了解HCV的复制机制.     

Tet-on和Cre/loxP系统双重调控HCV NS5B真核表达载体的设计与构建

目的:构建可受Tet-on和Cre/loxP系统双调控的HCVNS5B真核表达载体,为建立可严格调控HCV NS5B蛋白表达的转基因小鼠奠定基础.方法:以真核表达载体pBI-3为载体构建骨架,在其启动子下游依次插入luc报告基因、BGH pA和NS5B基因片段,并分别在luc报告基因上游和BGH pA尾下游引入一个loxP位点.结果:成功构建了可受Tet-on和Cre/loxP系统双调控的HCV NS5B真核表达载体pBI-3/luc-BGH pA-NS5B.结论:pBI-3/luc-BGH pA-NS5B真核表达载体的成功构建为可严格调控HCV NS5B蛋白表达转基因小鼠的建立打下了良好的基础.     

Tet-on和Cre/loxP系统双重调控表达丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶三转基因小鼠的建立

目的:建立Tet-On调控系统和Cre/loxP基因剔除系统双重调控表达丙型肝炎病毒(HCV)NS3/4A丝氨酸蛋白酶三转基因小鼠。方法:选择适龄并经鉴定的在Tet-on系统调控下肝脏特异性表达Cre重组酶的双转基因小鼠Lap/LC-1与在Tet-on系统调控下肝脏特异性表达萤光素酶(Luc)的双转基因小鼠Lap/NS3/4A交配,子代小鼠经PCR检测、筛选基因组中NS3/4A、Lap、LC-1等3个转基因片段均阳性的小鼠。三阳性的NS3/4A/Lap/LC-1小鼠经多西环素(Dox)诱导1周后,以在体生物发光成像系统(BLI)检测报告基因Luc的表达,免疫组化检测小鼠体内Cre重组酶、HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶的表达状况。结果:NS3/4A/Lap/LC-1小鼠经Dox诱导后,BLI结果显示仅在小鼠肝脏部位有强烈的发光信号,表明这些小鼠肝细胞内报告基因Luc特异高效表达;免疫组化结果证实Cre重组酶、NS3/4A蛋白酶仅在经诱导后的小鼠肝细胞中特异性表达。结论:建立了Tet-On调控系统和Cre/loxP基因剔除系统双重调控下表达HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶的三转基因小鼠模型,为进一步研究HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶在HCV感染后与宿主相互作用的机制,以及抗NS3/4A丝氨酸蛋白酶特异性抑制剂的筛选奠定了基础。     

小鼠对表达HBV截短肽的耻垢分枝菌的免疫应答

分别以生理盐水、pcDNA3.1(-)空质粒、重组真核质粒pcDNA3.1(-)-C-preS1(简称基因免疫组)、耻垢分枝杆菌和重组耻垢分枝杆菌(简称重组耻垢免疫组)注射BALB/c小鼠,各组均免疫2次,每次间隔3周。末次注射后进行连续抗体测定,最后处死小鼠分离脾细胞,进行淋巴细胞增殖实验和细胞毒性T细胞杀伤实验。重组耻垢免疫组抗体滴度升高幅度前期低于基因免疫组(P<0.05),后者45 d达到峰值1∶5 100。前者抗体滴度第60 d达到峰值1∶6 900,45 d后重组耻垢免疫组抗体滴度高于基因免疫组(P<0.05),且维持时间较基因免疫组更长(P<0.05)。基因免疫组诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖刺激指数低于重组耻垢免疫组(P<0.05)。后者诱导的特异性CTL杀伤率最高可达到50.2%,而前者最高为31.6%,二者有显著区别(P<0.05)。     

乙型肝炎病毒S基因与截短C基因融合的穿梭表达载体的构建

研究目的是构建HBVS基因和截短C基因融合的胞壁型和分泌型大肠杆菌和分枝杆菌(E．coli-BCG)穿梭质粒。采用PCR方法从结核分枝杆菌MTB毒株H37Rv的基因中扩增出相对分子质量为19000的抗原胞壁区及其上游调控元件基因,克隆入穿梭载体pOLYG中。以含HBV基因组的质粒pCP10序列为模板,PCR扩增获得5基因片段Sw和C基因编码氨基端的部分基因片段Ct,克隆入胞壁型穿梭表达载体pCW和分泌型穿梭表达载体pDE22。经酶切和序列测定证实,胞壁型和分泌型载体pCW-Sw-Ct和pDE22-Sw-Ct构建成功。为进一步研究含S基因和截短C基因融合的重组BCG活疫苗奠定了基础。     

丙型肝炎病毒解旋酶在大肠杆菌中的表达纯化及鉴定

解旋酶(helicase)在HCV基因组复制中负责RNA的解链,在复制中起着关键的作用。利用反转录PCR,从HCV患者血液中扩增出解旋酶基因,克隆入原核表达载体pProEXHTb,成功构建了HCV解旋酶原核表达质粒pProEXHTb-helicase。重组质粒转化DH5α大肠杆菌,经IPTG诱导表达后,表达产物经SDS-PAGE和Westernblot证实系解旋酶,并用镍离子亲和层析方法获得纯化解旋酶。