限制修饰系统cglI赋予钝齿棒杆菌抗噬菌体功能活性

为解决氨基酸发酵工业中的噬菌体污染问题, 对cglI基因复合体在钝齿棒杆菌中的功能活性表达进行研究。通过PCR从谷氨酸棒杆菌基因组扩增cglI基因复合体, 构建重组质粒pJL23-cglI, 转化钝齿棒杆菌T6-13后得到重组菌株。定性和定量检测重组菌株的噬菌体抗性。实验结果表明, 携带cglI基因复合体的重组钝齿棒杆菌显示了明显的抗噬菌体功能活性和较广的抗噬菌体谱, 进而证实了cglI基因复合体用于构建钝齿棒杆菌抗噬菌体菌株的可行性, 为解决氨基酸发酵生产中的噬菌体污染问题提供了一种有效方法。     

抗噬菌体重组钝齿棒杆菌的生理稳定性

为了探索抗噬菌体重组钝齿棒杆菌的应用可行性,对重组质粒pJL23-cglⅠ在钝齿棒杆菌中的稳定性以及其对宿主细胞生长代谢的影响进行了研究。实验结果表明,重组质粒在钝齿棒杆菌中具有较好的稳定性,它在钝齿棒杆菌中的存在对重组菌株的早期生长有些影响,但未影响重组菌株的谷氨酸产生量。     

以葡萄糖为底物一步法合成γ-氨基丁酸整合型重组钝齿棒杆菌的构建

[目的]为了构建一株直接利用廉价的葡萄糖合成γ-氨基丁酸的重组钝齿棒杆菌,将来自于植物乳杆菌γ-氨基丁酸合成途径的关键酶谷氨酸脱羧酶基因(lpgad)在产谷氨酸菌株钝齿棒杆菌中进行整合表达,实现葡萄糖到GABA的一步法生产.[方法]运用PCR技术扩增得到带有tac启动子的谷氨酸脱羧酶基因tacgad.通过重叠PCR的方法获得钝齿棒杆菌精氨酸合成途径关键酶N-乙酰谷氨酸激酶(NAGK)基因内部缺失型基因△argB.利用自杀载体pK18mobsacB构建同源整合载体pK18-△argB::tacgad,以△argB的上下游序列为同源臂,通过两次同源重组将tacgad基因整合到钝齿棒杆菌基因组,同时将NAGK基因argB灭活,利用蔗糖致死基因sacB反向筛选标记筛选得到谷氨酸脱羧酶的重组钝齿棒杆菌C.crenatum △argB::tacgad.重组钝齿棒杆菌以葡萄糖为底物进行发酵,测定GABA含量.[结果]重组菌C.crenatum △argB::tacgad成功表达谷氨酸脱羧酶,同时阻断了精氨酸合成途径对谷氨酸到GABA代谢途径的竞争,粗酶液基本检测不到NAGK活性,发酵液无精氨酸合成.通过96 h发酵,重组菌可积累约8.28 g/L的GABA.[结论]本研究通过将谷氨酸脱羧酶基因定向整合到钝齿棒杆菌精氨酸合成途径的关键酶基因argB内部,成功表达谷氨酸脱羧酶的同时阻断竞争途径精氨酸的合成.本研究为实现直接利用葡萄糖合成GABA的一步法生产奠定了基础.     

钝齿棒杆菌溶氧诱导型启动子的筛选及其功能验证

[目的]筛选钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA5-5内源溶氧诱导型启动子,验证其在不同溶氧条件下受溶氧调控的功能.[方法]以本课题组前期利用双向电泳结合质谱鉴定技术分离鉴定出的高低供氧条件下钝齿棒杆菌SYPA5-5胞内的显著差异蛋白(27个)为基础,结合棒杆菌基因组信息分析高低溶氧状态下显著差异蛋白中单位拷贝的表达量,以其中单位拷贝表达量高的蛋白为目的蛋白,克隆目的蛋白编码基因的上游启动子,分别替换棒杆菌-大肠杆菌穿梭表达质粒pDXW-8的外源tac启动子,在大肠杆菌和钝齿棒杆菌中表达报告基因gfp和cat,并检测其表达效率.[结果]筛选出高溶氧上调蛋白转酮醇酶和延胡索酸水化酶作为目的蛋白,克隆其启动子区命名为P-tkt和P-fum.在重组大肠杆菌和重组钝齿棒杆菌中,P-tkt在高溶氧条件下CAT活性是低溶氧条件下CAT活性的2.8和3.2倍.该结果在5L发酵罐中得到验证.[结论]启动子P-tkt为首次筛选到的钝齿棒杆菌内源性高溶氧诱导型启动子,适用于高溶氧条件发酵生产氨基酸的菌株中,有利于在高供氧条件下提高棒杆菌中氨基酸的合成代谢能力.     

钝齿棒杆菌N-乙酰鸟氨酸转氨酶的克隆表达分析及其重组菌的精氨酸发酵

N-乙酰鸟氨酸转氨酶 (EC 2.6.1.11,ACOAT) 是钝齿棒杆菌Corynebacterium crenatum精氨酸合成途径中的第4个酶,催化底物N-乙酰谷氨酸半醛生成产物N-乙酰鸟氨酸。为研究N-乙酰鸟氨酸转氨酶在钝齿棒杆菌中精氨酸合成中的作用,考察其酶学性质,对培养基成分和发酵过程工艺条件的优化提高精氨酸产量提供依据。从精氨酸高产菌株钝齿棒杆菌SYPA 5-5染色体扩增获得ACOAT编码基因argD,全长1 176 bp,编码390个氨基酸,在Escherichia coli BL21(D     

钝齿棒杆菌GlnK在氮代谢调控及L-精氨酸合成中的功能

【目的】钝齿棒杆菌是重要的氨基酸生产菌株,本研究针对氮代谢PⅡ信号转导蛋白GlnK展开相关功能研究,分析其在钝齿棒杆菌氮代谢调控及L-精氨酸合成中的作用。【方法】以GlnK蛋白为研究对象,通过基因敲除等遗传方法获得过表达、敲除及敲弱glnK的重组钝齿棒杆菌,研究GlnK对NH_4~+吸收的影响,通过RT-qPCR和酶活测定,从转录水平和蛋白水平上揭示GlnK对氮代谢和L-精氨酸合成相关基因表达水平及酶活的影响,通过5-L发酵罐发酵产L-精氨酸研究GlnK对L-精氨酸合成的影响。【结果】过表达glnK能明显促进NH_4~+的吸收,而敲除glnK后则会抑制NH_4~+的摄取;RT-qPCR和酶活测定发现,相比于野生型菌株Cc5-5,glnK过表达菌株Cc-glnK中与铵吸收相关的基因,表达量平均上调约4.58倍,L-精氨酸合成基因簇中基因的表达水平平均上调1.50倍。Cc-glnK中氮代谢相关蛋白的酶活平均提高46.97%;L-精氨酸合成途径上7个关键酶的酶活平均提高30.00%;5-L发酵罐发酵各重组菌株结果表明,Cc-glnK菌株的产量可达49.53 g/L,产率为0.516 g/(L·h),相比于出发菌株Cc5-5,其L-精氨酸产量提高了28.65%。【结论】过表达GlnK能促进NH_4~+的吸收及利用,并通过影响L-精氨酸合成途径上关键基因的表达水平,提高关键酶的酶活,最终提高L-精氨酸的产量。本研究为后续探索钝齿棒杆菌氮代谢调控机制及代谢工程改造钝齿棒杆菌生产L-精氨酸提供了一种新的策略。     

CglI基因在大肠杆菌中的功能活性分析

通过PCR技术从谷氨酸棒杆菌基因组中扩增CglI基因,克隆到载体pMD18-T Simple后测序。将CglI基因亚克隆到表达载体pJL23,构建重组质粒pJL23-CglI,转化大肠杆菌HB101菌株,通过PCR反应筛选鉴定阳性克隆。通过噬菌体感染实验,初步分析了CglI基因在大肠杆菌中的功能活性。     

钝齿棒杆菌精氨酸琥珀酸酶编码基因argH的克隆表达及其重组菌发酵产精氨酸研究

钝齿棒杆菌（Corynebacterium crenatum）SYPA是本实验室筛选获得的一株高产精氨酸生产菌株。精氨酸琥珀酸酶（AL）是精氨酸合成过程中的最后一个酶,催化底物精氨酸琥珀酸生成产物精氨酸。为进一步提高精氨酸产量,本文以钝齿棒杆菌基因组为模板,扩增得到其编码基因argH,全长为1434 bp,编码476个氨基酸,理论蛋白分子量大小为50.8 kDa,其与C. glutamicum ATCC 13032比对其同源性为99.4%,相差10 bp,3个氨基酸。将其在E.coli BL21(DE3)及C. crenatum SYPA中成功表达。利用载体pET-28a上的6×His?Tag选用Ni柱亲和层析纯化AL,纯化后获得的重组蛋白的比酶活达156.9mU/mg蛋白,总回收率为72.3%,对该酶的部分酶学性质进行了初步研究,并发现产物精氨酸对其具有反馈抑制作用。成功构建钝齿棒杆菌重组穿梭表达质粒pJC1-tac-argH并将其通过电击转化法转入C.crenatum SYPA中,加强其代谢途径中AL蛋白表达量,并对其发酵产精氨酸做了初步分析。结果表明与出发菌株相比,转化子在精氨酸琥珀酸酶酶活增强了66.8%的基础上精氨酸产量达40.9 g/L,比出发菌株产量的35.8 g/L提高了约14.2%。     

钝齿棒杆菌argR基因克隆、表达及其重组菌发酵产精氨酸研究

钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)AS.M7是筛选获得的一株高产精氨酸生产菌株。ArgR是精氨酸合成过程中的一种调控蛋白。为进一步验证其在钝齿棒杆菌中对精氨酸合成量的影响,利用特异性引物,分别扩增标准菌C. creantum AS 1.542和诱变菌C. creantum AS.M7的argR全长基因,测序后比较二者的差异;结果表明标准菌argR基因ORF全长516 bp,编码一个含172个氨基酸残基的蛋白;而诱变菌argR基因的109位碱基由C替换为T,导致ArgR蛋白在钝齿诱变菌中表达被提前终止。同时,将来源于标准菌的argR基因连接到穿梭表达载体pXMJ19中,电击转化至诱变菌C. crenatum AS.M7 得到重组菌株,用摇瓶发酵的方法观测重组菌产精氨酸量的变化。SDS-PAGE和Western blot分析证明标准菌的argR基因在诱变菌中得到了表达。对重组诱变菌产精氨酸量进行了测定,结果显示:产精氨酸能力由原来7.8 mg/ml下降至2.5 mg/ml,下降了约67.9%。     

以原生质体融合技术构建广谱抗噬菌体菌株

利用１５株不同品系的噬菌体作筛子筛选的噬菌体抗性自发突变株只对其相应的筛于噬菌体具抗性,为窄谱抗株。利用原生质体融合技术把北京棒杆菌７３３８与钝齿棒杆菌Ｔｓ－Ｌｉ进行融合得融合于ＺＧ８８,通过噬菌体吸附试验,血清学试验证明ＺＧ８８细胞表面结构发生了较大的改变,失去了噬菌体的吸附位点。因此ＺＧ８８是广谱稳定的噬菌体抗性菌株。     

钝齿棒杆菌N-乙酰谷氨酸激酶基因的克隆、序列分析及表达

以钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)野生株AS 1.542及产精氨酸突变株971.1的基因组为模板,用PCR方法扩增出N-乙酰谷氨酸激酶基因(argB)片段。核酸序列分析结果表明,该片段全长1505bp,包含一个ORF,推测此ORF区编码一条317个氨基酸的多肽,分子量为33.6kDa。C.crenatum野生株AS 1.542与突变株971.1的argB基因序列比较,发现只在结构区有一个核苷酸的差别但没有引起氨基酸变化。野生株AS 1.542argB基因的编码区核苷酸序列与C.glutamicumATCC 13032、Corynebacterium efficiensYS-314和Escherichia colik12的同源性分别是99.89%、76.62%和37.94%,而氨基酸同源性分别是100%、78.55%和25.25%。在C.crenatum argB基因上游存在启动子区域。经IPTG诱导该基因在棒杆菌中得到有效表达,野生株AS 1.542为宿主的重组子酶活明显提高。突变株971.1为宿主的重组菌酶活提高一倍,精氨酸积累提高约25%。     

钝齿棒杆菌天冬氨酸激酶基因的克隆和序列分析

运用PCR方法,从野生型钝齿棒杆菌株(Corynebacterium crenatum)AS1542及具有AEC抗性的突变株CD945染色体上分别扩增出天冬氨酸激酶(AK)基因(ask),构建了重组质粒。核苷酸序列分析表明,C.crenatum AS1542AK基因与C.crenatum CD945相比,第1199位的碱基由T变为C,引起酶蛋白β亚基第80位氨基酸从亮氨酸变成脯氨酸。该氨基酸的突变在蛋白结构上位于ACT结构域内,该区受赖氨酸调控。C.crenatum AS1542的AK基因的编码区核苷酸序列与C.glutamicum\,C.flavum及B.lactofermentum相比,同源性分别为97.23%、97.55%和97.62%,酶蛋白氨基酸序列的同源性分别为99.76%、99.52%和99.76%。但在AK基因的启动子上游序列部分与其它棒杆菌相比有较大差异。     

钝齿棒杆菌乙酰谷氨酸激酶编码基因argB的克隆表达、纯化及酶学性质研究

本研究的钝齿棒杆菌(Gorynebacterium crenatum SYPA)是筛选得到的高产精氨酸突变菌株,其中argB基因编码的乙酰谷氨酸激酶(NAGK)是精氨酸合成过程中的关键酶。为了进一步研究该酶的相关特性,以钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum SYPA)基因组为模板,扩增得到其arB基因,成功构建了pET-28a-argB重组质粒,并在E.coli BL21(DE3)中诱导后高效表达。利用载体pET-28a上的His6·Tag标记选用Ni柱亲和层析法纯化表达具有活性的NAGK,纯化后酶的比活力达到7.28 U/mg,纯化倍数达66.18。并对该酶的酶学性质进行了初步研究,该酶的最适反应温度为30℃;最适pH值为9.0;酶学动力学参数以N-乙酰谷氨酸为底物的Km为3.35mmol/L;金属离子Cu~(2+)、Mn~(2+)、螯合剂对乙酰谷氨酸激酶均有明显的抑制作用。