PCR在猴B病毒鉴定中的应用研究

目的为鉴定新分离毒株是否为B病毒.方法根据ScinicarielloF报道的引物,用PCR方法扩增BV147、HSV-1、HSV-2,对扩增产物进行SacⅡ内切酶消化.结果这一对引物可同时对这3种病毒进行扩增,但只有BV147的扩增产物可被SacⅡ内切酶切开.对BV147扩增片段克隆测序的结果证实,其与美国B病毒E2490株部分基因(UL27)相对应位置的核苷酸同源性为100%.结论初步建立了检测B病毒DNA的PCR方法并测定了新分离病毒毒株的部分基因序列,证明新分离的病毒为B病毒.     

陕西省9株乙脑病毒的分离及E基因序列分析

分析陕西省分离的9株乙脑病毒基因组序列特征。使用乙脑病毒全基因组序列测定引物进行RT-PCR扩增,扩增产物进行测序,拼接后获得基因组序列。利用MEGA 4.1、MegAlin、MEGA7.0等软件进行毒株的系统进化分析,并与P3株、减毒活疫苗SA14-14-2株及覆盖5个基因型别的其他乙脑病毒进行E基因序列比对。9株分离株3株分离自猪舍、6株分离自羊舍,其中4株获得全基因组序列,5株测得E基因序列。基于E基因序列进行毒株核苷酸、氨基酸同源性比较,结果显示分离株均与基因I型GI-b亚型毒株核苷酸和氨基酸同源性最高,核苷酸同源性范围为96.5%～99.7%、氨基酸同源性范围99.2%～100.0%;与SA14-14-2株核苷酸同源性范围为87.5%～88.9%、氨基酸同源性范围96.3%～97.2%;与P3株核苷酸同源性范围为87.6%～88.1%、氨基酸同源性范围96.7%～97.6%。分析09年（陕南地区）分离株与18年（关中地区）分离株的E基因核苷酸差异率为1.8%～2.9%、氨基酸差异率为0%～0.8%。陕西省自然界中循环的乙脑病毒以基因Ⅰ型为主,与P3株在抗原毒力关键位点无差异,...     

流行性乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2E基因稳定性研究

为研究乙脑病毒减毒株SA14-14-2 E蛋白基因稳定性,将乙脑病毒减毒株SA14-14-2在原代地鼠肾细胞(PHK)上传至18代,应用RT-PCR分别扩增PHK6代、PHK7代、PHK8代、PHK13代、PHK18代E蛋白基因并测序后,与Genebank中乙脑病毒减毒株SA14-14-2(D90195)进行比较分析。PHK6、PHK7、PHK8代病毒与D90195 E蛋白核苷酸和氨基酸序列完全相同。PHK13、PHK18代病毒与D90195E蛋白核苷酸序列同源性分别为99.8%、99.7%,与D90195E蛋白氨基酸序列同源性分别为99.6%、99.4%。各代次病毒E蛋白与减毒相关氨基酸未发生改变,同时所有突变的氨基酸均非SA14原有的,故不是恢复性突变。结果表明乙脑病毒减毒株SA14-14-2的遗传学特性稳定,从分子水平证明乙脑病毒减毒株SA14-14-2及其生产的疫苗具有安全性。     

犬瘟热病毒临床流行野毒株F蛋白信号肽区分析

根据GenBank上发表的犬瘟热病毒(CDV)融合蛋白基因(F)序列,设计引物扩增F蛋白部分信号肽区,片段长369 bp.对2005年～2007年收集的犬瘟热阳性的水貂、狐、貉实质脏器、血液、尿液等样品进行扩增,获得了13个CDVF蛋白部分信号肽区基因片段.序列分析发现,CDV 野毒F蛋白该区段核苷酸与氨基酸序列与目前我国使用疫苗株CDV3及其他国内外疫苗株比较存在较大差异,与CDV3对应区段的核苷酸同源性在80.7%～83.2%之间,而推导的对应氨基酸序列同源性只有64.8%～71.3%.部分信号肽区的氨基酸疏水性分析,推测其调控功能也发生变化,本研究为CDV遗传变异和分子流行病学提供理论数据.     

猴泡沫病毒SFV-1前病毒pol基因克隆及序列分析

采用nested-PCR从猕猴肾组织细胞中获得同源性较高、具有高度保守序列的、长度为465 bp 大小的猴泡沫病毒SFV-1的 pol 基因的cDNA,将其克隆到pMD18-T载体中,并对其进行序列分析,分析结果表明所克隆的基因片断为猴泡沫病毒SFV-1 pol 基因片段,与文献中已发表的来源于灵长类动物SFV-1、SFV-1A、SFV-1B、SFV-2、 SFVmac、SFVkm的 pol 基因核苷酸序列进行比对,显示SFVkm1与上述病毒 pol 基因核苷酸同源性分别为91.06%、90.59%、90.82%、90.21%、89.41%、91.53%.对 pol 基因克隆和序列分析是了解和掌握SFV病毒分子流行病学及其变异趋势的重要手段,7 种不同基因型的泡沫病毒的系统进化树分析显示了SFVkm1与它们之间的相互联系.     

犬瘟热病毒TN株血凝基因的克隆与序列分析

用RT PCR方法对分离的TN野毒株H基因进行了扩增 ,并将其克隆到pGEM T载体上 ,进行核苷酸序列测定。结果TN野毒株H基因ORF全长 1 ,81 5bp ,编码 60 4个氨基酸。与GenBank中己报道的 7个CDV毒株相比 ,H基因核苷酸序列的同源性在 92 %～ 99%之间 ,推导的H蛋白氨基酸序列的同源性在 91 %～ 99%之间。TN株H蛋白潜在的N 联糖基化位点为 8个 ,而Onderstepoort弱毒株H蛋白为 4个 ;其中N端第 1 9～ 2 1、 30 9～ 31 1、 5 8     

猪细小病毒NS1基因的克隆与序列分析

目的:扩增猪细小病毒(Porcine Parvovinls,PPV)LJL12株NS1基因的全长序列,并进行同源性分析.方法:参考GenBank上公布的PPV中国株NS1基因序列,设计一对特异性引物增LJL12株NS1基因,测定序列,使用分子生物学软件进行同源性分析.结果:LJL12 株 NS1 基因伍长 1989bp,编码 662个氨基酸.与其他 PPV 中国株 NS1 的核苷酸同源性在 98.6%～100%之间,氨基酸同源性在98.5%～100%之间.其中,与南京株的同源性最高.结论:PPV NS1 蛋白具有高度保守性,适合用作诊断抗原.LJL12 株PPV NS1 基因的克隆,为进一步研究 NS1 的功能和作用奠定了基础.     

2012年在上海市发现中国大陆首例输入性D8基因型麻疹病例

本文对中国首例输入性D8基因型麻疹病毒基因特征进行分析。用ELISA法检测血清麻疹病毒IgM抗体;用Vero/Slam细胞对采集的咽拭子标本进行病毒分离,分离到的麻疹毒株用RT-PCR方法扩增其核蛋白基因3′端的部分序列,并对扩增产物进行核苷酸序列测定和分析,以3′端456个核苷酸为目的片段进行基因亲缘性关系分析。结果表明,上海市2012年共报告1 105疑似麻疹病例,其中实验室确诊590例,临床符合病例2例,排除513例,报告发病率为2.52/10万;共采集到984份疑似麻疹病例咽拭子标本,分离到247株麻疹病毒,病毒分离阳性率为25.3%;除Shanghai12-239为D8基因型外,其他均为H1a基因亚型。Shanghai12-239与世界卫生组织(World Health Organization,WHO)参考株(Manchester.UNK30.94(D8)AF280803)核苷酸序列同源性为97.8%,氨基酸序列同源性为98.6%。与WHO其他基因型参考株核苷酸序列同源性为89.6%~94.5%,氨基酸序列同源性为88.7%~95.3%。     

新疆奶牛戊型肝炎病毒RNA检测及序列分析

从新疆两个奶牛场的戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)抗体检测阳性的奶牛中分别采集牛粪便或肛拭子样品,利用反转录套式聚合酶链反应(RT-nPCR)检测所采集样品中的HEV RNA,结果来自第一个奶牛场的7份牛粪便样品为阳性,阳性率11.67%,来自第二奶牛场的1份肛拭子样品为阳性,阳性率为3.23%。将PCR扩增产物克隆、测序并进行序列分析,结果表明,对应于HEV ORF2 189bp核苷酸序列的8个牛源HEV基因组扩增片段的同源性为96.3%~100.0%,应当属于相同的基因型;它们与HEV 1、2、3和4型ORF2 189bp核苷酸平均同源性分别为78.5%~86.4%,81.7%~83.8%,79.1%~85.3%和84.3%~95.8%,与4型的同源性最高达93.2%~95.8%。基于这些已测序核酸片段绘制的基因进化树显示:本研究中的8株牛源HEV ORF2 189bp核苷酸序列与HEV 4型人源C5株、猪源swC3与swXJ株位于同一进化枝上,同属HEV基因4型,提示新疆奶牛中可能存在HEV感染,并且奶牛可能是人类HEV传染源中除猪之外的新宿主。     

2006年广州登革热病原体的分离鉴定及其生物学性质的观察

目的：对2006年广州流行登革热病原进行分离鉴定及生物学性质研究。方法：采用传代蚊细胞微量培养方法对2006年广州登革热病原进行分离,并通过脑内途径观察其对乳鼠的致病性;经间接免疫荧光和RT-PCR技术,对患者血清标本中的病毒特异抗体及新分离的病原体进行检测和鉴定;将此次分离的病原体与1980年分离的同型毒株进行生物学性质比较。结果：从57份患者血清标本中分离出10株病毒,在传代蚊细胞中可产生稳定的细胞病变并对乳鼠致病;其基因组为登革1型病毒特异的RNA分子,经鉴定为登革1型病毒;此次分离的登革1型病毒与1980年分离的同型毒株在致细胞产生病变的时间和严重程度,蚀斑的大小、形态以及致乳鼠发病的时间等生物学性质上有所不同。结论：2006年广州流行登革热病原为登革1型病毒,且与1980年分离的同型毒株在生物学性质方面存在明显差异。     

一种新的丙型肝炎病毒单链丝氨酸蛋白酶基因的构建、表达与鉴定

根据丙型肝炎病毒 (HCV)丝氨酸蛋白酶晶体结构特点 ,设计并构建了一种新的单链型丝氨酸蛋白酶分子 .该分子由辅因子NS4A的核心序列、柔性连接子GSGS和NS3丝氨酸蛋白酶结构域组成 .利用设计的 3条引物 ,通过 2轮PCR获得单链丝氨酸蛋白酶基因 ,插入原核表达载体pQE30中 ,转化大肠杆菌M15 ,获得重组克隆 .经低剂量诱导和低温培养 ,目的基因获得高水平可溶表达 .以金属螯合层析法纯化的重组蛋白纯度达 95 %以上 .间接ELISA法检测 98份血清证实 ,该蛋白具有良好的抗原性和特异性 ;以重组蛋白底物NS5ab和单链丝氨酸蛋白酶建立了简便、实用的丝氨酸蛋白酶体外活性检测系统 ;以该系统观察了PMSF和EDTA对蛋白酶活性的影响 .结果表明 ,PMSF能够抑制蛋白酶的酶切活性 ,而EDTA不能抑制酶的活性 .单链型HCV丝氨酸蛋白酶的成功表达以及体外活性检测系统的建立 ,为丝氨酸蛋白酶抑制剂的研制奠定了物质基础 .     

乙肝病毒基因组克隆及其线性分子侵染力研究

乙肝病毒基因组为环状双链DNA,常态环状分子侵染能力很强。为了探讨乙肝病毒基因组线性分子对人肝的侵染和复制能力,克隆了德国病人Brandt携带的乙肝病毒全长基因组,定名为HBV-Brandt。Multiplex PCR基因型鉴定表明HBV-Brandt属于乙型肝炎病毒A型。细胞转染和荧光定量PCR分析证明乙肝病毒HBV-Brandt的基因组线性DNA分子可以侵染HepG2细胞,并进行大量复制。     

我国登革 4型病毒 B5株基因组全序列的测定及分析(英文)

 对我国登革 4型病毒 B5株 (D4- B5)基因组进行全序列测定及分析 ,为研究病毒基因组结构与功能的关系及研制新型登革疫苗奠定基础 .根据登革 4型病毒 81 4669株的序列设计特异引物 ,通过 RT- PCR扩增出 D4- B5株不同长度的片段 ,分别克隆到 p GEM- T载体 ,将挑取的阳性克隆进行 PCR、酶切鉴定及序列测定 .结果显示 ,D4- B5株的基因组全长 1 0 665nt,5′和 3′非编码区分别为 1 0 1 nt和 40 3nt,中间一个长 1 0 1 61 nt的开放读码框架 ,编码 3387个氨基酸 .与 D4- 81 4669株比较 ,两者核苷酸序列同源性为 93.0 8% ,氨基酸序列同源性为 96.58% .D4- B5株的基因组全序列与 D4- 81 4669株类似 ,但也有较大差异 .同源进化分析表明 ,D4- B5株的基因型为 型 ,与登革 4型病毒菲律宾分离株亲缘关系较近 .这是首次报道的我国登革 4型病毒分离株基因组全序列 ,对研究病毒基因组结构与功能的关系 ,探讨我国毒株的地理来源及研制适合我国人群的新型登革疫苗具有一定的意义 .     

寡核苷酸芯片法、实时PCR 和测序法进行乙肝病毒 基因分型的比较

目的:比较寡核苷酸芯片法、实时荧光PCR和测序法在对慢性乙肝患者病毒基因分型的比较和方法学评价。方法:对126例不同基因型的慢性乙肝患者的血清样本分别用寡核苷酸芯片法、实时荧光PCR法和测序法进行基因分型,并评价各种方法的临床表现、所需时间和检测成本。结果:寡核苷酸芯片法、实时荧光PCR分别能检测到1%和0.1%比例的基因型。在126例慢性乙肝患者的临床样本中,寡核苷酸芯片法、实时荧光PCR和测序法分别检测出41(33%)、41(33%)和45(36%)例为B型,76(60%)、76(60%)、81(64%)例为C型。寡核苷酸芯片法、实时荧光PCR均检出9例B、C混合基因型。在三种检测方法中实时荧光PCR是最快速和廉价的。结论:寡核苷酸芯片法、实时荧光PCR能检出B、C混合基因型,而测序法只能检测出样本的主导基因型。     

套式RT—PCR方法检测临床样品中的猪流感病毒

猪流感是由猪流感病毒(Swine influenza vi rus, SIV)引起的一种呼吸道传染病,具有发病率高、死亡率低的特点,罹患流感的怀孕母猪还有并发流产的危险。猪流感已给我国养猪业带来严重危害。SIV属于正粘病毒科 A 型流感病毒属[1]。A型流感病毒可感染多种动物,一般认为,水禽是流感病毒的自然宿主和基因库,猪则是人流感病毒株与禽流感病毒株的中间宿主和混合器[1],通过基因重配产生抗原转移而导致新流感病毒株的出现。研究病毒两种受体[2],因此所有A型流感病毒都能感染猪,猪在流感病毒的生态分布中占有重要地位。目前猪流感的主要流行血…     

PCR技术在猴免疫缺陷病毒(SIV)感染模型中的应用

目的(1)建立RT PCR方法,定性测定SIV感染猴血浆中病毒RNA,比较其与传统血浆病毒分离方法的敏感性;(2)建立DNA PCR方法,检测SIV感染猴外周血淋巴细胞(PBMCs)中的前病毒DNA。(3)检验DNA PCR和RNA PCR方法在猴SAIDS模型应用中的实用性和可操作性。方法用SIVmac251静脉感染恒河猴,定期采血,从血浆中提取病毒RNA,以RNA为模板通过RT PCR法扩增,凝胶电泳定性;从感染猴PBMC中提取带有整合的SIV前病毒DNA的细胞基因组DNA,巢式PCR扩增,凝胶电泳定性。结果DNA PCR和RNA PCR经两轮扩增后均得到一长度为477bp的特异条带,测序鉴定确为目的片段。9只实验猴感染SIV后7d,RNA PCR结果为79阳性,DNA PCR结果为100%阳性,而血浆病毒分离只有59阳性;此后一直到感染后的42d,RNA PCR和DNA PCR的结果一直为100%阳性,而血浆病毒分离阳性率在感染后35d下降到49,到42d时下降为零。结论PCR方法比病毒分离方法的敏感性高。尤其是DNA PCR,既可检测具有活跃病毒复制的受感染细胞,又可检测那些携带病毒处于转录休眠期的细胞,所以在感染的早期和中后期———血浆病毒水平较低的情况下或病毒处于潜伏感染的阶段,它作为猴艾滋病(SAIDS)模型病毒学指标之一有其必要性和重要性。这个指标的检测方法应该是较血浆病毒RNA检测更为敏感。     

蓝舌病毒HbC株与不同种系细胞相互作用及群特异性抗原特征

BTV HbC株和蓝舌病毒标准株BTV 10分别接种在不同种系细胞如猴肾传代细胞 (Vero)、人宫颈癌细胞(Hela)和小鼠神经胶质瘤细胞 (C6)等细胞株上 ,比较研究了BTV HbC在不同种系细胞上的增殖特征 ,BTV HbC与BTV 10在相同细胞上的复制增殖特征 ,病毒与细胞相互作用的显微和超微结构特征。用免疫交叉反应研究了BTV HbC株与BTV 10型标准株之间的血清学关系。本研究结合本室对BTV HbC株基因组图谱分析和蓝舌病毒群特异性抗原编码基因S7的RT PCR分析 ,进一步证实了BTV HbC株可能是一个新的血清型蓝舌病毒     

北柴胡茎叶总黄酮抗流感病毒的作用

北柴胡 (BupleurumchinenseDC .)茎叶总黄酮 (TFB) 0 .0 9g kg剂量组对乙型流感病毒 (B 京防 98 76 )感染小鼠具有明显的保护作用 (P <0 .0 5 ) ,0 .0 3g kg和 0 .0 9g kg剂量组能明显降低乙型流感病毒 (B 京防 98 76 )感染小鼠肺指数值 (P <0 .0 5 ,P <0 .0 1) ,肺指数抑制率分别为 2 0 .5 %和 2 5 .4 %。组织病理学检查结果表明 ,TFB各剂量组与模型组比较 ,肺部病变均明显减轻 ,其中以TFB高剂量组肺部总体病变程度最轻 ,疗效最好。