基因免疫制备西尼罗病毒NS5蛋白特异性单抗

研究了NS5蛋白在西尼罗病毒的特异性检测方面的应用及NS5在黄病毒复制中的作用机理。采用RT．PCR方法扩增了西尼罗病毒株的NS5基因片段,将其克隆至真核表达载体pVAX1,构建真核表达质粒。以重组质粒免疫BALB／c小鼠后取脾脏进行杂交瘤细胞融合,建立能稳定分泌西尼罗NS5单克隆抗体的杂交瘤细胞株。构建了真核表达质粒pVAX1-WNV—NS5,免疫动物后获得了28289等4株稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,均为IgM型。真核表达质粒免疫后成功地诱导了针对NS5蛋白的体液免疫应答,单抗特异性分析显示4株单抗与其他黄病毒存在一定交叉反应。     

猪瘟病毒p80基因NTPase/RNA解旋酶功能区在E.coli中的表达

采用PCR技术扩增出猪瘟病毒GXYL株和C株p80基因的NTPase／RNA解旋酶功能区(sGXNS3和sCNS3),将其克隆到表达载体pET-30a( )中,获得重组质粒pET—sGXNS3和pET～sCNS3。PCR、酶切和序列分析鉴定目的基因插入位置、方向和读码框完全正确。1．0mmol／L IPTG诱导得到分子量为26kD的目的蛋白。Western blot检测表明,表达的目的蛋白能被CSFV阳性血清识别。     

猪水泡病病毒全基因组核苷酸序列的测定与分析

猪水泡病是由猪水泡病病毒(Swine vesicular disease virus,SVDV)引起的猪的一种急性传染病,在症状上与口蹄疫极其相似。该病流行性强,发病率高,能造成严重的公共卫生问题。国际兽医局将其列为动物A类传染病,我国农业部列为动物一类传染病。SVDV属于小RNA病毒科肠道病毒属,其核酸类型为单股正链RNA分子,无囊膜,病毒基因组含一个大的开放阅读框,编码一条由2185个氨基酸组成的多聚蛋白。     

一种新的丙型肝炎病毒单链丝氨酸蛋白酶基因的构建、表达与鉴定

根据丙型肝炎病毒 (HCV)丝氨酸蛋白酶晶体结构特点 ,设计并构建了一种新的单链型丝氨酸蛋白酶分子 .该分子由辅因子NS4A的核心序列、柔性连接子GSGS和NS3丝氨酸蛋白酶结构域组成 .利用设计的 3条引物 ,通过 2轮PCR获得单链丝氨酸蛋白酶基因 ,插入原核表达载体pQE30中 ,转化大肠杆菌M15 ,获得重组克隆 .经低剂量诱导和低温培养 ,目的基因获得高水平可溶表达 .以金属螯合层析法纯化的重组蛋白纯度达 95 %以上 .间接ELISA法检测 98份血清证实 ,该蛋白具有良好的抗原性和特异性 ;以重组蛋白底物NS5ab和单链丝氨酸蛋白酶建立了简便、实用的丝氨酸蛋白酶体外活性检测系统 ;以该系统观察了PMSF和EDTA对蛋白酶活性的影响 .结果表明 ,PMSF能够抑制蛋白酶的酶切活性 ,而EDTA不能抑制酶的活性 .单链型HCV丝氨酸蛋白酶的成功表达以及体外活性检测系统的建立 ,为丝氨酸蛋白酶抑制剂的研制奠定了物质基础 .     

一株斑点热立克次体的病原学研究

自内蒙古自治区的草原革蜱（D．Nuttalli）中分离到一株斑点热立克次体。用微量酶标染色方法进行血清学鉴定表明,系西伯利亚（Rickettsiaesibirica种血清型。G＋Cmol％含量为32.4％。对其核酸进行聚合酶链扩增／限制性核酸内切酶消化（PCR／RFLP）分析DNA长度多态性,分别引用立氏立克次体蛋白抗原基因Rr190序列作为扩增引物Rr190．70p～602n和Rr190．4442p～5664n,扩增后分别用Pst1和Rsal限制性核酸内切酶消化。其电泳图谱证     

猪瘟病毒E2基因主要抗原区的克隆及原核表达

利用反转录PCR（RT-PCR）和套式PCR（nest Polymerase Chain Reaction ,nPCR）技术扩增出当前猪瘟流行毒（广西玉林株,GXYL）与中国猪瘟兔化弱毒（C-株）兔脾组织毒E₂基因的主要抗原区,将其克隆到表达载体pP_ROEX-HTb中,获得重组质粒pP_ROEX-GXYL和pP_ROEX-C,经PCR、酶切和序列分析鉴定表明,插入的位置、大小和读码框均正确。 SDS-PAGE检测表明,经重组质粒pP_ROEX-GXYL和pP_ROEX-C转化、诱导的受体菌能表达E₂基因主要抗原区蛋白,Western-blot检测表明,诱导表达的抗原蛋白能与猪瘟阳性血清发生特异性反应。      

连续肾脏替代疗法治疗重症急性胰腺炎时机的探讨

目的:探讨连续肾脏替代疗法(CRRT)治疗重症急性胰腺炎的最佳时机。方法:选取我院收治的30例重症急性胰腺炎(SAP)患者为研究对象,按发病后行CRRT的时间分将患者随机为A、B两组,A组发病后72小时内治疗,B组发病后72小时后治疗,分析和比较两组治疗后的临床转归及生命体征变化、APACHEⅡ评分变化急性生理与慢性健康状况、住院费用、平均住院时间。结果:经CRRT治疗后,A组死亡率(14.3%)低于B组(43.7%),差异有统计学意义(P0.05);A、B两组治疗后体温、心率、呼吸、平均动脉压平稳,A组优于B组,差异有统计学意义(P0.05);A组的平均住院时间(15.7±8.9)d、住院费用(107000±65000)万元均明显优于B组,差异有统计学意义(P0.05);两组患者治疗后APACHEⅡ评分均明显优于治疗前,治疗后A组APACHEⅡ评分明显优于B组,差异显著有统计学意义(P0.05)。结论:早期行CRRT能明显改善重症急性胰腺炎患者的疗效和预后,最佳治疗时机可能为发病后72小时内。     

Mc3 和Mc5 在溃疡性结肠炎癌变过程中的意义*

目的:探讨Mc3和Mc5在溃疡性结肠炎-上皮内瘤变-癌变过程中的表达和临床意义。方法:利用免疫组化染色检测168例溃疡性结肠炎(UC)、溃疡性结肠炎伴上皮内瘤变(UC+IN)、结直肠癌(CRC)中Mc3和Mc5的表达情况,分析Mc3和Mc5的表达水平在溃疡性结肠炎-上皮内瘤变-癌变过程中变化趋势,探讨潜在的临床意义。结果:Mc3和Mc5在UC的表达阳性率分别为30%和29%,在UC+IN的阳性率分别是48%和46%,在CRC组的阳性率分别是91%和89%。统计分析发现,Mc3和Mc5在溃疡性结肠炎、上皮内瘤变和结直肠癌的表达逐渐增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:Mc3和Mc5在溃疡性结肠炎-上皮内瘤变-癌变过程中表达逐渐增加,检测Mc3及Mc5的表达有助于判断癌变风险,且Mc3和Mc5具有较好的一致性。     

重组红火蚁毒素致敏原Sol i1的表达及活性分析

【目的】为研究红火蚁Solenopsis invicta Buren毒素蛋白致病分子机理,制备用于红火蚁蜇伤防治的制剂。【方法】本研究采用反转录PCR（RT-PCR）与套式PCR（nPCR）扩增出红火蚁体内毒素蛋白Sol i1全基因及其活性基因片段Sol i1a,进行测序与序列分析,构建重组质粒Sol i1-pET43.1a 和 Sol i1a-pET43.1a, 经PCR、酶切和测序鉴定后转化BL21（DE3）进行IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE分析和Western blot检测后,用亲合层析法纯化,并将纯化的重组蛋白通过动物试验进行了致敏活性分析以及过敏体质治疗研究。【结果】本研究克隆的Sol i1基因序列与GenBank中红火蚁序列同源性为99%,原核表达预期大小的2种重组蛋白能与组氨酸单抗发生特异性反应,且具有较高的致敏活性和良好的免疫治疗效果。【结论】原核表达的2种重组蛋白Sol i1和 Sol i1a具有良好的生物活性,为红火蚁蜇伤的致病机理和防治研究奠定了基础。     

猪瘟病毒流行毒株E2基因密码子优化及在酵母中的高效表达

密码子的偏嗜性是影响基因异源表达的重要参数之一,优化密码子序列能够提高外源基因的表达水平。野生型猪瘟病毒E2基因在毕赤酵母中的表达量较低,为了提高E2基因在毕赤酵母中的表达水平,利用PCR基础上的定点突变技术将E2基因上的毕赤酵母低利用密码子突变为其高利用率的简并密码子。结果表明,替换野生型E2基因上24个酵母低利用密码子后,E2基因在酵母中表达水平有较显著提高,表明通过密码子优化提高E2基因在毕赤酵母中的表达这一策略是成功的。