新型冠状病毒S蛋白表达、纯化及应用

[目的]克隆严重急性呼吸综合征冠状病毒2(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-CoV-2)刺突糖蛋白(Spike,S蛋白),纯化重组蛋白为制备鼠多克隆抗体提供免疫原,并鉴定抗体活性。[方法]依据对S蛋白的氨基酸序列解析,设计并构建了S蛋白重组质粒S713 pcDNA3.1(+)-C-6His,经酶切和测序正确后,转入中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)中进行诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白表达情况。表达产物利用Ni柱和分子筛纯化,目的蛋白混合免疫佐剂AS03免疫ICR小鼠,制备S蛋白多克隆抗体并对通过中和实验进行鉴定。[结果]成功构建重组质粒S713 pcDNA3.1(+)-C-6His,在CHO-K1细胞中S蛋白以可溶性形式表达。可溶性目的蛋白纯化后,蛋白纯度为94.4%,作为免疫原制备鼠多克隆抗体,抗体效价为1∶400,中和实验显示该多抗具有保护作用。[结论]成功诱导表达、纯化重组S蛋白并制备其多克隆抗体,为深入研究新冠病毒感染、发病机制及新型肺炎的防治奠定基础。     

新型冠状病毒RBD蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

为原核表达严重急性呼吸综合征冠状病毒2（简称新型冠状病毒,severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2,SARS-CoV-2）S蛋白受体结合域（receptor binding domain, RBD）并制备多克隆抗体,利用基因克隆技术将RBD基因连接到原核表达载体pGEX-6p-1和pET-32a(+)上,电转化至大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞,利用优化后的表达条件大量表达重组蛋白,经亲和层析纯化后通过SDS-PAGE检测蛋白的表达情况。利用GST-RBD融合蛋白作为免疫抗原免疫小鼠制备多克隆抗体,ELISA和Western blot分析抗血清的效价和特异性。PCR鉴定和序列测定结果显示,成功构建了重组载体pGEX-RBD和pET-RBD,在大肠杆菌中实现了GST-RBD和RBD-His融合蛋白的可溶性高效表达。研究获得的多克隆抗体的滴度达到约1∶3 000,并具有良好的结合特异性。原核表达的可溶性新型冠状病毒RBD重组蛋白具有良好的免疫原性,为后续制备基因工程抗体奠定了实验基础。     

马链球菌马亚种IgG结合蛋白的原核表达和免疫原性

为研究马链球菌马亚种IgG结合蛋白(EAG)免疫原性和保护力,评价其作为马链球菌疫苗抗原的价值。采用PCR法扩增马链球菌马亚种EAG基因,将测序正确的EAG扩增产物与原核表达载体pET-28a(+)连接构建重组质粒,对转化后的大肠杆菌进行诱导表达,用诱导纯化后的重组蛋白作免疫原免疫小鼠,分析重组蛋白免疫小鼠后的抗体水平及对小鼠的免疫保护力。结果表明,诱导后可得到26 kDa的EAG重组蛋白,且该蛋白可与该菌阳性血清发生特异性反应。间接ELISA检测免疫小鼠的抗体效价可达1∶8 100,重组蛋白免疫后对小鼠保护力可达90%。该结果表明,表达的EAG蛋白具有良好的抗原性,可有效提高小鼠的体液免疫水平及免疫保护力。     

SARS-CoV核衣壳蛋白的表达与免疫研究

依据GenBank中SARS基因组序列,采用人工合成的方法合成编码SARS病毒N蛋白的全基因(1296bp)序列,再与设计的CTL特异性表位基因(195bp)重组后,克隆到pET-28a(+)质粒中,重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达.利用SARS患者恢复期阳性血清,鉴定表达蛋白.进一步纯化后免疫马,并用ELISA方法检测血清抗体效价.结果显示SDS-PAGE表明所表达的蛋白相对分子质量约为55000 Da,与预计大小相符;Westernblot显示表达的蛋白具有良好的抗原性和特异性.对表达蛋白形成的包涵体进行洗涤,得到的蛋白纯度可达到70.1%.切胶纯化免疫马后,获得的抗SARS抗体滴度达12560.为亚单位疫苗研制和精制抗SARS抗体免疫制剂提供基础.     

抗汉坦病毒NP scFv基因表达及生物活性分析

诱导已构建的重组质粒pGEX-6P—1—scFv原核表达抗汉坦病毒核衣壳蛋白单链抗体,并用酶免疫实验检测单链抗体生物活性。用IPTG诱导重组原核表达质粒pGEX-6P-1-scFv表达抗汉坦病毒NP单链抗体融合蛋白,经亲和层析纯化,并应用SDS—PAGE电泳检测单链抗体融合蛋白,应用酶免疫实验检测抗NP单链抗体生物学活性。SDS—PAGE电泳检测显示,原核重组质粒pGEX-6P-1-scFv已表达分子量约为56ku的单链抗体融合蛋白;酶免疫实验检测显示,单链抗体具有与汉坦病毒NP抗原特异性结合的生物学活性。结果表明,已构建的原核表达重组质粒pGEX-6P-1-scFv,能够成功表达具有与汉坦病毒NP抗原特异性结合生物学活性的单链抗体。     

融合表达新冠病毒S1与N蛋白的非复制型重组腺病毒的构建与鉴定

体外构建融合表达新型冠状病毒(SARS-CoV-2)S1抗原与N抗原的复制缺陷型重组腺病毒疫苗,为深入开展该疫苗免疫原性的研究提供基础。利用Overlap PCR和同源重组方法构建插入SARS-CoV-2的S1-N基因的重组腺病毒质粒pKAd5-S1-N,通过琼脂糖凝胶电泳、多酶切、测序等方法鉴定重组质粒正确性;重组质粒转染HEK293A细胞获得病毒毒种AdV5-S1-N并扩增,氯化铯密度梯度离心法纯化病毒,有限稀释分析法测病毒滴度,Western blot方法验证AdV5-S1-N重组腺病毒S1-N融合蛋白表达情况;将AdV5-S1-N疫苗通过肌肉注射途径免疫BALB/c小鼠,第14d采集颌下静脉血,ELISA法检测血清针对S1和N蛋白抗原的特异性抗体滴度。成功获得滴度为9.45×10¹¹IU/mL的重组腺病毒AdV5-S1-N。Western blot结果发现：AdV5-S1-N感染细胞后,融合蛋白可正常表达,与抗S1蛋白及抗N蛋白抗体均有特异结合。ELISA结果显示免疫重组腺病毒的小鼠可产生针对S1和N蛋白的特异性IgG抗体。应用复制缺陷型腺病毒载体成功获得...     

抗EGFRvⅢ单链抗体的原核表达条件的优化及纯化

为了构建抗EGFRvⅢ单链抗体大肠杆菌表达体系,优化抗EGFRvⅢ单链抗体在大肠杆菌中的表达条件,并建立纯化方法。构建抗EGFRvⅢ单链抗体的pET-22b(+)重组质粒,将其转化到大肠杆菌BL21中,研究不同温度、不同浓度诱导剂对目的蛋白表达效率的影响。用Ni2+亲和层析纯化蛋白,并通过免疫印迹对其进行鉴定。抗EGFRvⅢ单链抗体重组质粒经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切,菌落PCR和测序验证,结果显示重组质粒构建成功。SDS-PAGE结果表明BL21表达的目的蛋白相对分子量为29kD左右,与理论分子量一致,免疫印迹结果表明在29kD左右出现一条特异性条带,与SDS-PAGE结果一致。15℃和0.6μmol/L的诱导剂为抗EGFRvⅢ单链抗体的最佳诱导条件。本研究成功构建了抗EGFRvⅢ单链抗体大肠杆菌表达体系,并获得了大肠杆菌表达单链抗体的最佳诱导条件。     

东方马脑炎E2蛋白原核表达及免疫活性初步研究

为构建东方马脑炎病毒E2基因原核表达载体,完成E2蛋白表达及其免疫活性研究。利用PCR方法扩增E2编码全基因,大小为1 260 bp,将酶切后目的片段连接到原核表达载体pET-30a(+)上,构建成重组质粒pET30a(+)-EEEV-E2,采用酶切和测序分析方法鉴定正确的重组质粒转化到大肠杆菌BL21中,诱导E2蛋白表达,并用SDS-PAGE电泳和Western-blotting分析和鉴定目的蛋白;最后,用纯化的E2蛋白免疫BALB/c小鼠,小鼠随机分成4组:PBS对照组、弗氏佐剂对照组、E2蛋白免疫组和E2蛋白+弗氏佐剂免疫组,每组小鼠免疫2次,两次免疫间隔时间为14天,免疫剂量均为100μL/只;小鼠初次免疫后第10天,用细胞因子ELISA试剂盒检测血清中IL-6、IL-12与TNF-α的浓度,加强免疫后第14天,用EEEV的假病毒检测血清中E2蛋白抗体的中和作用。结果表明完成了E2基因的原核表达载体pET30a(+)-E2构建和成功表达了带有His标签的E2融合蛋白,蛋白以包涵体形式存在,大小为53.0 kDa;免疫小鼠血清中产生了高水平的IL-6、IL-12与TNF-α和具有较强中和作用的E2蛋白抗体。研究结果为今后E2蛋白作为基因工程亚单位疫苗的研究提供了重要参考。     

人冠状病毒NL63受体结合区蛋白的原核表达纯化与鉴定

人冠状病毒NL63受体结合区蛋白是其免疫学诊断和疫苗研究的主要靶点,在受体吸附、病毒进入细胞及膜融合中起关键作用。本研究在E.coli系统中进行人冠状病毒NL63受体结合区(RBD)大、小蛋白的表达纯化,并对其进行免疫学鉴定。首先密码子优化设计合成了HCoV-NL63的RBD大片段(RL:232-684aa)与小片段(RS:476-616aa)的编码基因,并将其克隆进硫氧还蛋白表达载体pM48,构建了人冠状病毒NL63的受体结合区蛋白(RBD)大(RL)、小(RS)片段与硫氧还蛋白的融合表达质粒;转化E.coli BL21pLys S,利用IPTG进行诱导表达,用镍亲和层析对蛋白进行纯化,并以表达HCoV-NL63RL与RS蛋白的重组痘苗病毒免疫小鼠血清对重组蛋白进行免疫印迹鉴定。结果表明在37℃,0.8mM IPTG诱导4h时,蛋白表达量达到最高,融合蛋白主要以包涵体形式表达,纯化后纯度可达95%以上。Western blot显示,两个融合蛋白均与痘苗病毒(天坛株)表达的HCoV-NL63RL与RS蛋白免疫的小鼠血清发生特异性反应。本研究首次在国内用原核系统表达纯化并鉴定了人冠状病毒NL63受体结合区大小蛋白(RL和RS),为人冠状病毒NL63感染的免疫学检测与疫苗研究提供了基础。     

SARS-CoV S蛋白受体结合区的重组表达及免疫原性分析

为了表达SARS-CoV的S蛋白的受体结合区并对其免疫原性进行分析,用PCR方法扩增S蛋白的受体结合区基因片段,克隆至原核表达质粒pET-32a+并在大肠杆菌中表达,应用Western-blot鉴定表达的目的蛋白,而后以该蛋白作为诊断抗原包被酶联板来检测20份SARS病人血清和28份健康人血清,结果原核表达的S蛋白能够和所用的SARS病人血清反应.这提示表达的S重组蛋白具有良好的抗原性.将变性纯化的重组蛋白和复性蛋白分别皮下免疫小鼠,第三次免疫一周后收集抗血清,用ELISA测定抗体和同时测定中和抗体活性.用变性的抗原免疫的小鼠血清均无中和活性;而用复性的蛋白免疫的小鼠产生了中和抗体.实验表明,S蛋白受体结合区无线性中和表位,中和抗体的产生是由构象表位诱导的.提示该蛋白有可能应用于亚单位疫苗的研究.     

Dhori病毒核蛋白基因的重组表达及其抗体制备

[目的]表达和纯化Dhori病毒(DHOV)核蛋白(NP),并制备多克隆抗体。[方法]RT-PCR扩增NP基因,并克隆至原核表达载体pET-28a和真核表达载体pcDNA3.1中。将重组质粒pET-28a-NP转化至大肠杆菌BL21中诱导表达,SDS-PAGE分析重组蛋白NP(rNP)的表达并亲和层析纯化rNP,以抗DHOV阳性羊血清检测其抗原性,免疫新西兰兔制备抗血清,以ELISA法检测其效价。将pcDNA3.1-NP转染至Vero细胞,以间接免疫荧光法评估抗体的结合活性,Western Blotting检测抗体与重组蛋白的特异性反应能力。[结果]pET-28a-NP和pcDNA3.1-NP重组质粒构建正确,原核表达的rNP约为55.3 kDa,并能被阳性羊血清识别,制备的抗体效价为1:409 600,能特异性识别真核及原核表达产物。[结论]成功表达和纯化rNP,并制备了多克隆抗体,可用于深入研究DHOV核蛋白的生物学特性及其检测试剂。     

真核表达纯化的SARS-CoV-2 N蛋白在不同人群血清检测中的应用性能分析

通过真核系统表达纯化新型冠状病毒（SARS-CoV-2）的全长核衣壳蛋白（Nucleocapsid protein,N蛋白）,分析其抗原性与应用性能。将SARS-CoV-2 N蛋白表达质粒转染HEK-293T细胞后,通过Western Blot和免疫荧光验证蛋白表达以及表达定位。对N蛋白进行纯化后,通过Western Blot和ELISA并采用多种血清样本（WHO参比品血清、正常人血清、新冠灭活疫苗接种后血清、新冠感染者恢复期血清）对该N蛋白在血清抗体检测中的应用性能进行分析。比较真核系统与原核系统表达的N蛋白抗原性上的差异,并分析基于真核系统表达N蛋白构建的IgG抗体ELISA检测体系与获批的商品化新冠RBD (Receptor binding domain)IgG抗体ELISA检测试剂盒及用于检测中和抗体的活病毒微量中和试验结果间的相关性。结果显示,真核系统表达的全长N蛋白主要定位于胞质,作为抗原检测新冠IgG抗体,具有比原核系统表达的N蛋白更高的检测灵敏度。针对新冠感染者恢复期血清,基于哺乳动物细胞表达的N蛋白构建的ELISA体系检测的IgG抗体滴度与试剂盒检测的RBD-IgG抗...     

SARS病毒s1基因片段真核表达载体的构建及免疫效果

本研究根据GenBank登录的BJ01株SARS-CoV序列合成801bpS1基因片段,该片段被亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)得到重组质粒pcDNA3.1(+)/S1;转染Hela细胞,SDS-PAGE、Western-Blotting鉴定蛋白表达;肌注免疫BALB/c小鼠,利用ELISA法检测免疫后小鼠的抗SARS/CoVIgG及IFN-γ水平,MTT法检测T细胞增殖活性.结果显示,重组质粒pcDNA3.1(+)/S1可在Hela细胞内表达S1蛋白,免疫后小鼠的T细胞增殖活性增强,抗SARS-CoVIgG与IFN-γ水平升高.本实验说明pcDNA3.1(+)/S1可诱导小鼠产生一定的体液免疫和细胞免疫应答.     

稳定表达乙型流感病毒血凝素蛋白细胞的构建

获得稳定表达乙型流感病毒血凝素蛋白的HEK-293-HA细胞株。采用RT-PCR方法扩增乙型流感病毒的HA基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)上,构建pcDNA3.1(+)-HA重组质粒。将已鉴定正确的pcDNA3.1(+)-HA质粒与辅助质粒PLV-EF1a-EGFP(2A)Puro通过脂质体介导法共转染HEK293细胞,经嘌呤霉素筛选后得到重组细胞株HEK293-HA,通过流式细胞术法(FCM)来检测细胞中HA的表达情况。所得到的重组细胞经扩大培养后再连续培养15代,采用间接免疫荧光法(IFA)和蛋白免疫印迹法(WB)来检测HA蛋白表达的稳定性。结果表明重组质粒pcDNA3.1(+)-HA经双酶切及测序鉴定正确;共获得3株高表达阳性细胞株。细胞扩大培养后连续传代培养15代后进行Western blot和IFA检测结果表明,重组细胞的HA蛋白得到稳定的表达。已成功获得了能稳定表达乙型流感病毒血凝素蛋白的HEK-293-HA细胞,可为乙型流感病毒HA蛋白的进一步研究提供良好的基础。     

马动脉炎病毒GL蛋白主要抗原域的表达及间接ELISA的初步建立

在分析马动脉炎病毒GL蛋白抗原性的基础上,设计一对引物克隆GL蛋白一段抗原性较好的抗原域编码基因。将克隆的基因插入pET-32a的BamHⅠ和XhoⅠ之间构建了GL蛋白主要抗原域原核表达载体pET-GL1。将pET-GL1质粒转化BL(21)宿主菌后,对培养和表达条件进行了优化,实现了EAV GL蛋白主要抗原域的高效表达。免疫印迹试验表明获得的表达产物具有良好的反应原性。应用His.Bind亲和层析柱纯化重组EAV-GL1蛋白,以纯化的重组GL1蛋白作为检测抗原,初步建立了检测马动脉炎病毒抗体的iGL1-ELISA。结果表明,抗原的最佳包被浓度为9.65μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶80,阳性标准初步定为:待检血清OD490>0.4,且待检血清OD490/阴性血清OD490>2。应用iGL1-ELISA对马血清样品进行检测,结果表明iGL1-ELISA与病毒中和试验的符合率达到94.1%,与国外同类试剂盒的符合率达到95.6%。     

羊口疮病毒蛋白ORFV035的表达、纯化和多克隆抗体的制备

克隆表达羊口疮病毒蛋白ORFV035,并制备其多克隆抗体,为后续对病毒复制、装配、形态发生和成熟过程的研究奠定基础。PCR扩增羊口疮病毒ORFV035基因,将其与质粒pET-30a(+)经Bam HⅠ和HindⅢ双酶切后连接,构建重组质粒pET30a-035。重组质粒经双酶切和测序鉴定,转化感受态大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定蛋白表达情况。表达产物进行超声破碎和Ni柱纯化,纯化后目的蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体并对其进行鉴定。成功构建了重组质粒pET30a-035,在大肠杆菌BL21中以包涵体形式高效表达。包涵体洗涤、溶解后进行Ni柱纯化,得到纯度较高的ORFV035-his融合蛋白。以纯化蛋白免疫小鼠获得多克隆抗体。Western blot检测显示该多抗可以识别天然ORFV035蛋白。成功诱导表达、纯化ORFV035蛋白并制备ORFV035多克隆抗体。     

SPA-Luc嵌合基因的构建及其融合蛋白活性检测

目的:葡萄球菌A蛋白-荧光素酶(SPA-Luc)原核表达载体的构建,表达,纯化,并对其生物学效应进行初步研究。方法:PCR扩增SPA和Luc基因,并连接到pET28a(+)中,构建原核表达质粒。构建正确的重组质粒转化至E.coliBL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE及Western Blot鉴定,同时用Ni-NTA亲和层析法纯化SPA-Luc蛋白,最后用荧光素酶试剂盒和ELISA检测融合蛋白的生物学活性。结果:成功构建重组质粒pET28a(+)-SPA、pET28a(+)-Luc和pET28a(+)-SPA-Luc,SDS-PAGE及Western Blot证明正确表达了重组蛋白,并获得了纯化的融合蛋白SPA-Luc。荧光素酶试剂盒检测发现该蛋白仍能与IgG结合,并且与兔和鼠的IgG有较高亲和性。ELISA显示SPA-Luc蛋白替代常规二抗检测抗原,具有更高的敏感性。结论:成功的克隆、表达、纯化的SPA-Luc蛋白可用于抗原抗体的检测,且比常规二抗具有更高的敏感性,为进一步研究其在免疫学中的应用奠定了实验基础。     

稳定携带新城疫病毒DNA疫苗减毒沙门氏菌的构建及其免疫原性

采用PCR技术从重组质粒pVAX1-F中扩增出新城疫病毒JS5株的融合蛋白(F)基因,将其克隆入真核表达质粒pmcDNA3.1 中,获得重组表达质粒pmcDNA3.1-F.通过电穿孔转化法将重组质粒转入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207,构建成功携带DNA疫苗的重组沙门氏菌SL7207(pmcDNA3.1-F).体内、体外试验结果表明,重组质粒pmcDNA3.1-F在沙门氏菌中的稳定性显著高于pcDNA3.1-F.将重组菌SL7207(pmcDNA3.1-F)和SL7207(pcDNA3.1-F)分别以1×109 CFU剂量两次口服免疫BALB/c小鼠,免疫小鼠可产生针对新城疫病毒F蛋白的血清抗体和黏膜抗体.重组菌以5×109 CFU剂量两次口服免疫4日龄SPF鸡,免疫鸡产生的针对新城疫病毒F蛋白的血清抗体和小肠黏膜抗体效价水平与空载体组之间存在显著性差异(P＜0.05).免疫保护试验结果显示,SL7207(pmcDNA3.1-F)和SL7207(pcDNA3.1-F)免疫组的免疫保护率均与空载体组之间存在显著性差异(P＜0.05),且SL7207(pmcDNA3.1-F)免疫组的保护率较SL7207(pcDNA3.1-F)免疫组提高了20.0%,说明稳定携带新城疫病毒DNA疫苗的减毒沙门氏菌具有良好的免疫原性和免疫保护性.     

一种展示SARS冠状病毒受体结合区的重组枯草杆菌芽孢的制备及免疫原性分析

目的：利用枯草杆菌芽孢呈递技术制备表达SARS冠状病毒S蛋白受体结合区（RBD）的重组芽孢。方法：将枯草杆菌 CotB 基因构建到基因组整合质粒pDG1664中,再将 RBD 基因连接到 CotB 基因的下游,构建成重组质粒pDG1664-CotB-RBD,通过同源重组整合到PY-79枯草杆菌基因组中;利用红霉素抗性筛选重组菌并进行PCR和DNA测序鉴定,Western印迹鉴定重组菌芽孢表面RBD蛋白的表达情况;用表达RBD的重组芽孢以口服方式免疫小鼠,通过ELISA和流式细胞术检测重组芽孢的免疫原性。结果：制备出枯草杆菌基因组整合了RBD抗原基因的重组菌株RS1931,形成的重组芽孢表达相对分子质量约62×103的CotB-RBD融合蛋白;重组芽孢免疫的小鼠血清RBD抗原特异性IgG抗体滴度在末次免疫后2周可达1∶10880,重组芽孢初免后18周的小鼠脾细胞中IFN-γ＋CD4^＋、IL-4＋CD4^＋和IFN-γ＋CD8^＋T细胞比例上调,表明重组芽孢经口服免疫产生良好的体液免疫和细胞免疫应答。结论：针对SARS冠状病毒S蛋白RBD建立了枯草杆菌芽孢呈递技术方法,制备出在枯草杆菌芽孢表面稳定表达外源RBD蛋白的重组株,获得的重组芽孢具有良好的免疫原性,为开发芽孢呈递型SARS疫苗奠定了基础。     

鸭坦布苏病毒E蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

目的用RT-PCR技术扩增鸭坦布苏病毒(DTMUV)AH-F10株E基因,并克隆至pET32a(+)载体,构建重组表达质粒pET32a-E,表达E蛋白。方法重组表达质粒转化感受态细胞BL21(DE3),经IPTG诱导后,获得含6个His标签的融合蛋白,大小约54kDa。表达的蛋白以包涵体形式存在。对目的蛋白进行纯化,用纯化的E蛋白免疫Balb/c小鼠,制备多克隆抗体血清。结果SDS-PAGE和Western blot试验结果表明E基因在大肠埃希菌中成功表达,并能与抗DTMUV多克隆抗体产生特异性反应,具有良好的反应原性。间接免疫荧光试验表明免疫小鼠后获得的多克隆抗体能与DTMUV反应。结论本研究为DTMUV新型疫苗和诊断试剂盒的进一步研究奠定了基础。