新型冠状病毒N蛋白原核可溶性表达与血清学评价

目的:利用原核系统可溶性表达新冠病毒(SARS-CoV-2)N蛋白,评价其在血清学诊断上的可行性。方法:将SARS-CoV-2 N蛋白对应的核酸表达序列克隆到载体pET-DsbC上,经原核表达和亲和纯化获得可溶性DsbC-N融合蛋白,通过ELISA试验检测30份确诊新冠肺炎患者、50份健康人血清,评价重组DsbC-N蛋白在新冠肺炎患者血清学诊断中的应用价值。结果:DsbC-N融合蛋白在原核表达系统中以可溶性形式表达,经亲和层析纯化后相对分子质量为68×103,纯度为92%。ELISA结果显示纯化后的DsbC-N蛋白与新冠肺炎患者血清有较强的反应,血清学诊断敏感性为96%,特异性为98%。结论:原核可溶性表达的DsbC-N蛋白经纯化后在新冠肺炎诊断方面具有很高的应用价值,可以作为诊断抗原用于检测患者血清中的抗体。     

SPA-Luc嵌合基因的构建及其融合蛋白活性检测

目的:葡萄球菌A蛋白-荧光素酶(SPA-Luc)原核表达载体的构建,表达,纯化,并对其生物学效应进行初步研究。方法:PCR扩增SPA和Luc基因,并连接到pET28a(+)中,构建原核表达质粒。构建正确的重组质粒转化至E.coliBL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE及Western Blot鉴定,同时用Ni-NTA亲和层析法纯化SPA-Luc蛋白,最后用荧光素酶试剂盒和ELISA检测融合蛋白的生物学活性。结果:成功构建重组质粒pET28a(+)-SPA、pET28a(+)-Luc和pET28a(+)-SPA-Luc,SDS-PAGE及Western Blot证明正确表达了重组蛋白,并获得了纯化的融合蛋白SPA-Luc。荧光素酶试剂盒检测发现该蛋白仍能与IgG结合,并且与兔和鼠的IgG有较高亲和性。ELISA显示SPA-Luc蛋白替代常规二抗检测抗原,具有更高的敏感性。结论:成功的克隆、表达、纯化的SPA-Luc蛋白可用于抗原抗体的检测,且比常规二抗具有更高的敏感性,为进一步研究其在免疫学中的应用奠定了实验基础。     

风疹病毒多表位诊断抗原的制备与评价

原核表达与层析纯化获取风疹病毒(Rubella Virus,RV)多表位诊断抗原,并初步评价其抗原性。将RV衣壳蛋白C aa 3~29、aa 96~123以及包膜糖蛋白E1aa208~247三个主要免疫显性表位串联,密码子优化后全基因合成;利用基因重组技术将多表位串联片段插入带有GST标签的表达质粒中,在大肠杆菌中进行表达,并利用亲和层析和离子交换层析纯化目的蛋白;利用Western Blot(WB)技术对目的蛋白抗原性进行鉴定,并建立RV-IgM抗体检测ELISA技术,初步评价此方法对阴阳血清样本的鉴别能力。获取高度均质的RV多表位诊断抗原,WB实验表明目的蛋白不但可以被anti-GST单克隆抗体识别,还可以被anti-RV多克隆抗体、RV-IgM阳性血清相应抗体所识别。分别对48份RV急性感染病例的阳性血清、阴性血清和健康人血清进行检测,发现一致性优异。原核表达与层析纯化可以获取抗原性良好的RV多表位诊断抗原,偶联HRP后可以作为检测抗原应用于RV-IgM ELISA血清学检测中。     

基于猪德尔塔冠状病毒重组核衣壳蛋白的ELISA抗体检测方法的建立与评价

【目的】猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是近年来新发现的一种猪肠道冠状病毒,2014年首次暴发于美国,随后亚洲多个国家也相继报道,对养猪业构成了巨大威胁。以大肠杆菌表达纯化的PDCoV重组核衣壳(N)蛋白为包被抗原,建立检测PDCoV抗体的间接ELISA方法,为PDCoV的血清抗体检测和流行病学调查提供工具。【方法】以PDCoV CHN-HN-2014株的基因组RNA为模板,通过RT-PCR扩增PDCoV核衣壳蛋白(N)基因的全长cDNA,将其插入原核表达载体pET-30a中,构建原核表达质粒p ET30a-N,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达,以纯化的重组N蛋白为包被抗原,建立PDCoV N-ELISA抗体检测方法,评估其特异性、敏感性、稳定性,并用于临床血清的检测。【结果】SDS-PAGE电泳检测证实表达的重组N蛋白主要以可溶性形式存在,Western blotting证实表达的重组蛋白具有反应活性。用纯化的重组蛋白建立的N-ELISA具有良好的特异性、敏感性、稳定性。与中和试验同时检测148份免疫猪血清和102份临床血清,两种方法的阳性符合率为88.99%,阴性符合率为92.90%,总符合率为91.20%。用建立的ELISA方法检测267份临床血清,PDCoV抗体阳性血清的比率为66.67%。【结论】建立的猪德尔塔冠状病毒N-ELISA抗体检测方法与中和试验的符合率高,可用于PDCoV血清抗体检测和流行病学调查。     

SARS-CoV S蛋白受体结合区的重组表达及免疫原性分析

为了表达SARS-CoV的S蛋白的受体结合区并对其免疫原性进行分析,用PCR方法扩增S蛋白的受体结合区基因片段,克隆至原核表达质粒pET-F32a＋并在大肠杆菌中表达,应用Western—blot鉴定表达的目的蛋白,而后以该蛋白作为诊断抗原包被酶联卡反来检测20份SARS病人血清和28份健康人血清,结果原核表达的S蛋白能够和所用的SARS病人血清反应。这提示表达的S重组蛋白具有良好的抗原性。将变性纯化的重组蛋白和复性蛋白分别皮下免疫小鼠,第三次免疫一周后收集抗血清,用ELISA测定抗体和同时测定中和抗体活性。用变性的抗原免疫的小鼠血清均无中和活性;而用复性的蛋白免疫的小鼠产生了中和抗体。实验表明,S蛋白受体结合区无线性中和表位,中和抗体的产生是由构象表位诱导的。提示该蛋白有可能应用于亚单位疫苗的研究。     

血清学诊断中结核杆菌磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶的应用

[目的]在原核系统中表达结核杆菌磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate car-boxykinase PEPCK),并研究该蛋白在诊断结核病人血清抗体中的应用价值.[方法]应用基因重组技术表达重组蛋白结核杆菌磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶,经亲和层析法纯化表达产物.用表达的重组蛋白免疫小鼠,研究其免疫学特性.间接酶联免疫吸附试验(Enzyme link immunosorbent assay,ELISA)检测结核病人血清中特异性IgG抗体,并与结核杆菌抗体胶体金法诊断试剂盒检测结果对比.[结果]试验表明转化入大肠杆菌中的重组质粒能够表达并纯化出相对分子量为72 kDa的重组蛋白;Western blot证实重组蛋白能够与小鼠抗BCG血清发生特异性反应;重组蛋白免疫小鼠后,小鼠血清中的抗体滴度可达1∶1280以上;重组蛋白用作ELISA包被抗原检测病人血清阳性率为17.3%(30/173),其中排菌病人的阳性率为32.5%(13/42),不排菌病人的阳性率为12.9%.该方法结果与结核杆菌抗体胶体金法诊断试剂盒的检测结果相比,敏感性为51.0%,特异性为96.7%.[结论]结核杆菌PEPCK具有较好的免疫原性和抗原性,有可能作为结核病血清学诊断的一组抗原之一.     

小鼠OAZ2基因的原核表达及抗体制备

目的:克隆小鼠鸟氨酸脱羧酶抗酶2(OAZ2)功能基因,原核表达、纯化OAZ2蛋白并制备抗OAZ2多克隆抗体.方法:IRT-PCR法从鼠黑色素瘤细胞总RNA中克隆OAZ2 cDNA后,通过重叠延伸PCR技术构建无需移码即可全长翻译的功能基因.将OAZ2功能基因克隆人原核表达载体pET15b并原核表达.表达的蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化后,用SDS-PAGE和Western Blot分析鉴定.用纯化的OAZ2蛋白作为抗原免疫Bab/C小鼠以制备多克隆抗体,制备抗体用ELISA和Western Blot检测抗体滴度和特异性.结果:成功获得小鼠OAZ2 cDNA并构建出无需移码翻译的OAZ2功能基因.OAZ2功能基因在大肠杆菌BL21(DE3)中可诱导性高表达并能用Ni-NTA树脂高效纯化.用纯化蛋白免疫Bab/C小鼠制备的抗血清经ELISA检测有较高的多克隆抗体效价(＞1∶64000),经Western blot鉴定可与纯化的OAZ2蛋白质特异性结合.结论:建立了鼠OAZ2蛋白原核表达和纯化技术,制备出高效价和特异性抗OAZ2多克隆抗体,为进一步研究OAZ2基因的功能奠定了基础.     

真核细胞表达单纯疱疹病毒Ⅰ型包膜糖蛋白B及其抗原性与免疫原性分析

为在真核细胞中表达并纯化I型单纯疱疹病毒(HSV I)包膜糖蛋白gB,并分析其抗原性和免疫原性,化学合成了包膜糖蛋白gB1胞外区基因片段,构建真核表达载体,并转染至HEK293细胞,表达的蛋白用羊抗HSV1+HSV2血清作为一抗,用ELISA检测其抗原性;用纯化的gB1蛋白免疫昆明小鼠,观察诱发抗体产生的时间及其效价,并用ELISA和Western blot检测小鼠抗gB1多克隆抗体特异性识别重组gB1抗原的能力,评价其免疫原性。结果显示在HEK293细胞中成功表达重组gB1蛋白,ELISA证实羊抗HSV1+HSV2多抗能够识别重组gB1蛋白;重组gB1蛋白免疫小鼠7周后,小鼠血清中多克隆抗体效价达到5×103,表明在真核细胞中高效表达并纯化的重组gB1蛋白具有良好的抗原性和免疫原性,为HSV检测试剂和疫苗研究提供了理论基础。     

马尔堡病毒糖蛋白GP1亚基的真核表达与纯化

目的:用真核表达系统可溶性表达重组马尔堡病毒糖蛋白GP1亚基并纯化。方法:从糖蛋白(GP)全长基因上扩增GP1基因序列,克隆至真核表达载体pcDNA3.4,在哺乳动物表达系统中进行表达,镍柱亲和层析纯化目的蛋白,ELISA检测重组蛋白与特异抗体的免疫反应性。结果:GP1在哺乳动物表达系统中获得可溶性表达,纯化得到的目的蛋白与特异抗体具有良好的结合活性,推测其构象与天然马尔堡病毒GP1具有相似性。结论:真核表达了马尔堡病毒糖蛋白GP1亚基,且目的蛋白具有良好的抗原性,可用于GP特异抗体筛选、疫苗效果评价等研究。     

肺炎衣原体ompA基因VD2-VD3区重组蛋白在血清学诊断中的初步应用

应用聚合酶联反应(PCR)技术,从肺炎衣原体Chlamydia pneumoniae的主要外膜蛋白(Major Outer Membrane Protein,MOMP)编码基因(ompA)上扩增出抗原优势表位VD2-VD3区基因,构建原核表达系统并诱导表达重组蛋白,经Ni-NTA亲和层析法纯化表达产物。间接酶联免疫吸附试验(Enzyme link immunosorbent assay,ELISA)检测人血清中特异性IgG抗体。试验表明,转化入BL21大肠杆菌的重组质粒,能表达并纯化出相对分子质量(Mr)为24KD的重组蛋白。Western blot证实重组蛋白只与Cpn MOMP mAb发生特异性反应;重组蛋白用作ELISA包被抗原检测Cpn阴阳性参比血清,特异性和灵敏度均为100%;对126位冠心病患者血清进行的检测中,该间接ELISA法与晶美公司Cpn IgG ELISA诊断试剂盒的检测结果相比,符合率达到96.3%。结果证实,制备的重组蛋白MOMPVD2-VD3具有良好的免疫活性,在Cpn血清学诊断的应用中具有较大的利用价值。     

人WWP2蛋白的重组表达和多克隆抗体的制备

[目的]克隆、表达并纯化人E3泛素连接酶蛋白WWP2的部分肽段(aa 324-517),制备兔源抗WWP2多克隆抗体并初步鉴定。[方法]PCR法从人胚肾细胞HEK-293T中扩增WWP2蛋白部分肽段的编码序列并构建原核表达质粒,大肠杆菌中诱导表达;GST亲和层析法纯化后进行TEV酶切,免疫新西兰兔制备多克隆抗体;间接ELISA、Western Blot、免疫荧光等方法检测抗体的灵敏度和特异性。[结果]构建了原核表达质粒pGEX-GST-WWP2(aa 324-517),原核表达并纯化了该重组蛋白。间接ELISA测定抗体效价可达1∶100 000以上,Western Blot检测该抗体可特异性识别体外纯化的WWP2蛋白和细胞内源性WWP2蛋白,细胞免疫荧光可检测到内源性WWP2蛋白。[结论]成功克隆、表达与纯化WWP2蛋白的部分肽段,制备出抗WWP2蛋白的多克隆抗体,可用于WWP2的免疫印迹和细胞免疫荧光分析。     

新型冠状病毒假病毒的制备及血浆中和抗体检测

新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引发新型冠状病毒肺炎（COVID-19）全球大流行。由于SARS-CoV-2生物安全管理的要求,高效制备获得高滴度的新型冠状病毒假病毒对基于S蛋白研发疫苗、中和抗体、病毒入侵抑制剂药物以及人群血清学调查等十分重要。本研究基于慢病毒系统,对制备新型冠状病毒假病毒过程中的重要参数进行优化,用Western Blot检测假病毒S蛋白和p24蛋白的表达及假病毒包装情况,用荧光素酶报告系统检测假病毒感染入侵效率。利用制备好的假病毒对恢复期血浆的中和抗体水平进行检测。结果显示骨架质粒与野生型Spike质粒为2∶1比例,在转染后48h收集上清为SARS-CoV-2野生型假病毒包装的最佳条件。与野生型相比,恢复期血浆对四种突变株的中和抗体滴度均降低,对B.1.351株中和能力最弱,B.1.617.2株其次,重型患者恢复期血浆对野生型和突变株的中和抗体滴度高于轻型与普通型患者。本研究优化了新型冠状病毒假病毒包装的实验室条件,评估了COVID-19患者恢复期血浆对野生型及四种突变株的中和抗体水平,提示未来对突变株的免疫逃逸进一步加强监测的重要性。     

单纯疱疹病毒I型糖蛋白D胞外区的真核表达及生物学活性分析

单纯疱疹病毒 (Herpes simplex virus,HSV) 包膜糖蛋白D (glycoprotein D,gD) 是HSV的结构蛋白之一,具有重要抗原表位,是目前疫苗研究的热点。为了分离纯化HSV gD1糖蛋白胞外区片段并对其生物学活性进行分析,本研究将化学合成的gD1胞外区基因片段克隆至真核表达载体pCEP4,重组质粒转染HEK293细胞进行瞬时表达,产物经Western blotting检测后用亲和层析法进行分离纯化,ELISA检测其抗原性。以纯化的重组蛋白作为抗原免疫小鼠,ELISA测血清特异性抗体效价以评价其免疫原性。构建的重组质粒经测序显示基因序列完全正确。表达产物的Western blotting分析发现,在相对分子量约46 kDa处有外源蛋白表达,与预期蛋白带一致。用Ni柱得到了纯化的重组gD1蛋白,ELISA检测显示其具有良好的抗原性,免疫小鼠7周后血清中抗体效价达到5×103。重组gD1蛋白的抗原性及免疫原性分析为HSV检测试剂和基因重组亚单位疫苗的研制提供了实验依据。     

真核细胞表达单纯疱疹病毒I型包膜糖蛋白B及其抗原性与免疫原性分析

为在真核细胞中表达并纯化I型单纯疱疹病毒（HSV I）包膜糖蛋白gB,并分析其抗原性和免疫原性,化学合成了包膜糖蛋白gB1胞外区基因片段,构建真核表达载体,并转染至HEK293细胞,表达的蛋白用羊抗HSV1+HSV2血清作为一抗,用ELISA检测其抗原性;用纯化的gB1蛋白免疫昆明小鼠,观察诱发抗体产生的时间及其效价,并用ELISA和Western blot检测小鼠抗gB1多克隆抗体特异性识别重组gB1抗原的能力,评价其免疫原性。结果显示在HEK293细胞中成功表达重组gB1蛋白,ELISA证实羊抗HSV1+HSV2多抗能够识别重组gB1蛋白;重组gB1蛋白免疫小鼠7周后,小鼠血清中多克隆抗体效价达到5×103,表明在真核细胞中高效表达并纯化的重组gB1蛋白具有良好的抗原性和免疫原性,为HSV检测试剂和疫苗研究提供了理论基础。     

SARS-CoV S蛋白受体结合区的重组表达及免疫原性分析

为了表达SARS-CoV的S蛋白的受体结合区并对其免疫原性进行分析,用PCR方法扩增S蛋白的受体结合区基因片段,克隆至原核表达质粒pET-32a+并在大肠杆菌中表达,应用Western-blot鉴定表达的目的蛋白,而后以该蛋白作为诊断抗原包被酶联板来检测20份SARS病人血清和28份健康人血清,结果原核表达的S蛋白能够和所用的SARS病人血清反应.这提示表达的S重组蛋白具有良好的抗原性.将变性纯化的重组蛋白和复性蛋白分别皮下免疫小鼠,第三次免疫一周后收集抗血清,用ELISA测定抗体和同时测定中和抗体活性.用变性的抗原免疫的小鼠血清均无中和活性;而用复性的蛋白免疫的小鼠产生了中和抗体.实验表明,S蛋白受体结合区无线性中和表位,中和抗体的产生是由构象表位诱导的.提示该蛋白有可能应用于亚单位疫苗的研究.     

小鼠Prune蛋白DHH结构域的原核表达及多克隆抗体的制备

[目的]表达、纯化小鼠Prune蛋白DHH结构域(m-Prune D),并制备多克隆抗体。[方法]生物信息学方法分析m-Prune D氨基酸序列;PCR扩增目的基因m-Prune D,克隆入原核表达载体p ET28a(+);IPTG诱导目的基因表达,SDS-PAGE和Western Blot鉴定蛋白表达,亲和层析法纯化蛋白;用纯化的重组m-Prune D免疫小鼠制备多克隆抗体;Western Blot检测多克隆抗体特异性。[结果]PCR成功扩增m-Prune D基因,双酶切及测序结果表明成功构建m-Prune D原核表达载体,SDS-PAGE和Western Blot鉴定表明成功表达约25 k Da的重组蛋白。纯化蛋白免疫小鼠后抗体滴度最高可达1∶25 600,所制备的多克隆抗体可特异性识别原核和真核细胞中DHH结构域蛋白。[结论]在E.coli中成功表达小鼠Prune蛋白DHH结构域,制备了多克隆抗体血清,可用于Prune蛋白生物学功能的进一步研究。     

钼还原菌中TrxR的原核表达及多克隆抗体制备

[目的]构建枯草芽孢杆菌硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase,TrxR)原核载体,表达、纯化TrxR重组蛋白,制备并鉴定多克隆抗体。[方法]通过分子克隆获得TrxR蛋白的表达菌株;利用镍离子亲和层析获得纯化的TrxR重组蛋白,免疫兔子制备TrxR蛋白多克隆抗体;采用ELISA法测定抗体效价;Western Blot检测抗血清的特异性。[结果]TrxR重组载体双酶切结果与DNA测序鉴定结果一致,蛋白表达纯化条带大小与预测一致。ELISA法测定抗血清效价为7×104,Western Blot证实抗血清有较高的特异性。[结论]成功克隆、表达与纯化TrxR重组蛋白,制备并鉴定兔子多克隆抗体,为TrxR的生物学功能研究奠定基础。     

六种致病性白蛉病毒原核表达核蛋白抗原性初步研究

初步研究六种致病性白蛉病毒原核表达核蛋白(Nucleocapsid protein,NP)抗原的抗原性,为开发相应的血清学诊断试剂提供理论依据。利用原核表达系统表达纯化六种致病性白蛉病毒核蛋白,并分别免疫新西兰白兔。通过间接ELISA方法及Western-blotting方法对所获得的兔免疫血清进行交叉反应检测,确定其抗体ELISA滴度。此外,分别用上述六种致病性白蛉病毒NP抗原包被ELISA反应板并对发热伴血小板减少综合征病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)病人血清进行间接ELISA检测,确定其血清学交叉反应及IgG抗体滴度。通过原核表达系统表达并纯化的六种白蛉病毒NP抗原浓度及纯度均达到免疫和检测要求。ELISA及Western-blotting检测结果显示六种病毒NP抗原兔免疫血清中的每种血清与其余五种病毒NP抗原可能存在血清学交叉反应。SFTSV病人血清与除SFTSV-NP以外的五种NP抗原亦可能存在部分交叉反应。本研究初步评价了原核表达的六种致病性白蛉病毒核蛋白的抗原性和免疫反应性,为相应诊断试剂的研制奠定了基础。     

日本脑炎病毒SA14-14-2 E蛋白结构域Ⅲ的抗原性和免疫原性分析

为了表达日本脑炎病毒囊膜蛋白(E蛋白)结构域DⅢ区,了解其作为亚单位疫苗的可能性,本研究根据SA14-14-2病毒株序列(GenBank Accession No.D90195)设计两条引物,以全长JEV感染性克隆pBR-JTF为模板,通过PCR扩增出JEVE蛋白DⅢ的cDNA片段,构建了原核表达载体pET-JEDⅢ,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)进行融合表达。融合蛋白为可溶性表达,表达量约占菌体蛋白的75%。用纯化后蛋白免疫新西兰兔和BALB/C鼠,通过ELISA,Western blotting,噬斑减少实验,及乳鼠攻毒实验验证JEDⅢ的抗原性和免疫原性。Western blotting及ELISA结果表明纯化后的表达产物具有良好的抗原性,纯化的JEDⅢ蛋白免疫新西兰兔,可以获得高达1:7×105滴度的抗JEV特异性抗体;JEDⅢ蛋白免疫BALB/C鼠,可以获得1:8.2×104滴度的抗JEV特异性抗体。并且获得1:256滴度的中和抗体,乳鼠攻毒实验能达到75%的保护效果。以上结果说明本研究表达、纯化的重组JEDⅢ蛋白,免疫小鼠以及兔后,能产生抗JEV的特异性抗体,中和性抗体,能够保护部分乳鼠接受毒...     

幽门螺杆菌重组vacA-CtxB蛋白的原核表达及免疫学研究

目的原核表达幽门螺杆菌pQE-vctB(含H.pylori细胞空泡毒素毒性片段与霍乱毒素B亚单位的融合基因)在E.coil DH5α中诱导表达,以获得重组蛋白,鉴定其抗原性和免疫原性,为制备防治H.pylori感染的口服疫苗奠定基础。方法 (1)pQE-vctB转化E.coli DH5α,IPTG诱导表达重组蛋白VCTB,Western blot分析抗原性,镍离子柱纯化。(2)重组蛋白VCTB口服免疫小鼠,ELISA检测小鼠血清特异性IgG、小肠冲洗液IgA,以鉴定其免疫原性。结果重组蛋白VCTB经SDS-PAGE分析相对分子量(Mr)约为40kD,亲和层析后可获得纯度为92%以上的蛋白。Western blot分析显示能与VacA抗血清反应。ELISA检测显示,免疫小鼠的血清特异性抗体IgG,肠粘液IgA显著高于VacA对照组(P0.01)。结论 vacA和ctxB融合基因原核表达质粒转化E.coli DH5α表达菌获得了重组蛋白VCTB,表达量较高,纯度较高,有良好的抗原性和免疫原性,口服免疫小鼠可明显提高其免疫效果,产生较高水平的IgA,可用于制备防治H.pylori感染的口服疫苗。