用人MHC转基因小鼠模型鉴定高致病禽流感病毒核蛋白CTL表位

目的:筛选高致病禽流感病毒核蛋白(NP)中可用于高致病禽流感病毒感染检测或疫苗设计的CTL表位,为评价疫苗接种效果和开发新型疫苗奠定基础。方法:根据NCBI公布的NP的核苷酸序列设计特异性引物,以2006年深圳株高致病禽流感H5N1病人分离的病毒cDNA为模板扩增NP全长基因(1500 bp)并测序。通过生物信息学方法,预测NP氨基酸序列中潜在的HLA-A觹0201限制性表位。构建重组pJW4303-NP核酸疫苗并肌肉免疫HLA-A2/DP4转基因小鼠,利用ELISPOT法筛选特异性CTL表位。结果:克隆了2006年深圳株高致病禽流感NP基因,构建的重组pJW4303-NP核酸疫苗能在体外COS-7细胞中表达,免疫小鼠后能引起小鼠产生特异性的体液免疫和细胞免疫。结论:生物信息学和转基因小鼠模型筛选相结合的方法,能用于高致病性禽流感核蛋白CTL表位的筛选。     

一种展示SARS冠状病毒受体结合区的重组枯草杆菌芽孢的制备及免疫原性分析

目的：利用枯草杆菌芽孢呈递技术制备表达SARS冠状病毒S蛋白受体结合区（RBD）的重组芽孢。方法：将枯草杆菌 CotB 基因构建到基因组整合质粒pDG1664中,再将 RBD 基因连接到 CotB 基因的下游,构建成重组质粒pDG1664-CotB-RBD,通过同源重组整合到PY-79枯草杆菌基因组中;利用红霉素抗性筛选重组菌并进行PCR和DNA测序鉴定,Western印迹鉴定重组菌芽孢表面RBD蛋白的表达情况;用表达RBD的重组芽孢以口服方式免疫小鼠,通过ELISA和流式细胞术检测重组芽孢的免疫原性。结果：制备出枯草杆菌基因组整合了RBD抗原基因的重组菌株RS1931,形成的重组芽孢表达相对分子质量约62×103的CotB-RBD融合蛋白;重组芽孢免疫的小鼠血清RBD抗原特异性IgG抗体滴度在末次免疫后2周可达1∶10880,重组芽孢初免后18周的小鼠脾细胞中IFN-γ＋CD4^＋、IL-4＋CD4^＋和IFN-γ＋CD8^＋T细胞比例上调,表明重组芽孢经口服免疫产生良好的体液免疫和细胞免疫应答。结论：针对SARS冠状病毒S蛋白RBD建立了枯草杆菌芽孢呈递技术方法,制备出在枯草杆菌芽孢表面稳定表达外源RBD蛋白的重组株,获得的重组芽孢具有良好的免疫原性,为开发芽孢呈递型SARS疫苗奠定了基础。     

SARS-CoV S蛋白受体结合区的重组表达及免疫原性分析

为了表达SARS-CoV的S蛋白的受体结合区并对其免疫原性进行分析,用PCR方法扩增S蛋白的受体结合区基因片段,克隆至原核表达质粒pET-F32a＋并在大肠杆菌中表达,应用Western—blot鉴定表达的目的蛋白,而后以该蛋白作为诊断抗原包被酶联卡反来检测20份SARS病人血清和28份健康人血清,结果原核表达的S蛋白能够和所用的SARS病人血清反应。这提示表达的S重组蛋白具有良好的抗原性。将变性纯化的重组蛋白和复性蛋白分别皮下免疫小鼠,第三次免疫一周后收集抗血清,用ELISA测定抗体和同时测定中和抗体活性。用变性的抗原免疫的小鼠血清均无中和活性;而用复性的蛋白免疫的小鼠产生了中和抗体。实验表明,S蛋白受体结合区无线性中和表位,中和抗体的产生是由构象表位诱导的。提示该蛋白有可能应用于亚单位疫苗的研究。     

抗新型隐球菌荚膜相关蛋白CAP10单克隆抗体的制备及鉴定

目的:以新型隐球菌荚膜相关蛋白CAP10为靶抗原,制备并鉴定特异性抗CAP10的单克隆抗体。方法:用纯化的重组CAP10免疫BALB/c小鼠,血清抗体效价达到适当水平时进行细胞融合;经多次亚克隆筛选出分泌特异性抗体的细胞株,制备单抗腹水并进行抗体效价测定及亚类鉴定。结果:获得11株能稳定分泌抗新型隐球菌荚膜相关蛋白CAP10的单克隆抗体杂交瘤细胞株,抗体效价高且抗原特异性强。结论:获得了针对新型隐球菌荚膜相关蛋白CAP10的单克隆抗体,为深入研究CAP10蛋白的功能,以及临床新型隐球菌的检测和血清型分析奠定了基础。     

中东呼吸综合征冠状病毒假病毒系统的建立及其在中和抗体检测中的应用

目的:为了避免中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)感染与中和试验中操作活病毒带来的生物安全隐患,构建只具有一次感染能力而无复制能力的MERS假病毒,建立MERS假病毒系统,并应用于中和抗体检测。方法:构建含有MERS-CoV S基因的重组质粒pcDNA3.1-MERS-S,与缺失Env基因、含有萤光素酶报告基因的HIV-1骨架质粒pNL4-3.Luc.RE共转染293T细胞,收获含有假病毒的上清;通过Western印迹、细胞感染实验和血清中和试验,确定是否包装出MERS假病毒,及是否能有效应用于细胞感染与中和试验。结果:MERS假病毒pMERS-S培养上清经Western印迹鉴定出相对分子质量为25×103的HIV-1 P24蛋白和相对分子质量为180×103的MERS-CoV S蛋白;与阴性对照假病毒pEnv-相比,pMERS-S能有效感染MERS-CoV敏感细胞系Huh-7,在感染细胞中产生荧光信号,感染细胞的假病毒量与产生的荧光信号呈明显的量效关系;在MERS假病毒中和试验中,pMERS-S能被MERS-CoV中和抗体中和而失去感染力,反映抗体对MERS-CoV的中和活性。结论:建立了不依赖于BSL-3高等级生物安全条件的MERS假病毒系统,并有效应用于中和抗体检测,为MERS-CoV疫苗、药物评价及病毒致病机制研究提供了良好的技术支撑手段。     

SARS冠状病毒S受体结合区蛋白片段在杆状病毒载体中的表达及其抗原性研究

目的:利用Bac-to-Bac1杆状病毒系统,在sf9昆虫细胞中表达严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒(SARS-CoV)的S受体结合区蛋白片段,并对其免疫原性进行研究。方法:将S蛋白的受体结合区基因片段定向克隆至转座载体pFast-Bac1,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,用抗生素平板筛选重组杆粒。脂质体介导重组杆粒转染sf9昆虫细胞,待细胞形态明显改变后收获细胞和培养上清液。利用SARS病人恢复期抗血清做ELISA和Western印迹,分析重组蛋白的抗原性。结果:ELISA和Western印迹表明,在sf9昆虫细胞中表达的SARS-CoVS受体结合区重组蛋白可与SARS病人恢复期抗血清发生特异反应。结论:获得了在昆虫细胞内表达的SARS-CoVS受体结合区重组蛋白,并证明该蛋白有可能用于SARS感染的抗体检测,为SARS-CoV免疫机制及其疫苗的进一步研究奠定了基础。     

树鼩CD3ε全长编码序列的克隆及分子特征分析

树鼩可作为人类疾病的良好模型,但缺乏对其免疫功能研究的基本标志和单克隆抗体。该研究应用RT-PCR技术,分别从3只树鼩的肝脏、脾脏和血液中克隆了CD3ε全长编码序列并用Discovery Studio等软件对其分子特征进行了分析。结果显示,树鼩CD3εcDNA的开放阅读框全长582bp,编码193个氨基酸。树鼩与其他哺乳动物的CD3ε蛋白整体结构近似,与人和恒河猴CD3ε的亲缘关系较近,胞内域与跨膜域高度保守,但胞外域出现2个潜在的糖基化位点,表面电荷亦存在差异。该研究为今后制备树鼩CD3单克隆抗体及功能研究奠定初步的基础。     

表达miR-192的重组腺病毒的构建及其在肝细胞中的表达分析

目的：构建表达miR-192的重组腺病毒,感染HepG2细胞建立miR-192高表达的细胞模型,以研究miR-192在肝细胞中的功能。方法：将miR-192前体基因插入腺病毒穿梭载体pAdTrack,构建miR-192穿梭载体pAdTrack-miR-192,经线性化和同源重组,构建重组腺病毒载体pAd-miR-192;线性化后,在QBI-293A细胞中进行病毒包装;用包装成功的重组腺病毒感染HepG2细胞,72h后收集细胞,提取总RNA,逆转录后进行定量PCR,检测miR-192和潜在靶分子视网膜母细胞瘤基因1（RBl）mRNA的变化。结果：获得670bp的miR-192前体基因,经过穿梭载体后重组构建表达miR-192的腺病毒载体pAd-miR-192;将pAd-miR-192转染QBI-293A细胞,第8d细胞病变及荧光的表达结果表明重组腺病毒成功包装;感染HepG2细胞后,定量PCR检测表明miR-192的表达较对照增加了835．87倍,同时检测到细胞中RBlmRNA的表达显著降低。结论：构建了高效表达miR-192的腺病毒,建立了miR-192高表达的肝细胞模型,证明在肝细胞中抑制的RBl是miR-192靶分子,为后续miR-192在肝细胞中功能的研究奠定了基础。     

RAPD技术在黑糯玉米亲缘关系划分上的应用

以8个黑糯玉米自交系为试验材料,利用CTAB微量提取法从幼苗中提取DNA,进行RAPD扩增,筛选出3个能产生稳定遗传多态性的引物,分别是OP—A01、OP—A11和OP-006;利用这些引物的扩增出的指纹图谱,进行聚类分析,可将8个自交系划分为4个类群,与各个自交系的来源基本一致。表明RAPD可以用于黑糯玉米亲缘关系的划分。     

LPS/D-GalN诱导小鼠急性肝损伤模型的建立

目的建立脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)/D-氨基半乳糖(D-galactosamine,D-GalN)诱导小鼠急性肝损伤模型。方法 40只雌性C57BL/6小鼠用于观察8种不同LPS与D-GalN剂量配比联合刺激后小鼠存活时间,以确定模型建立的最佳剂量。使用腹腔注射最佳剂量染毒32只雌性C57BL/6小鼠,分别在0、1、4、8 h处死,每组8只,0 h注射相同剂量生理盐水作为对照。观察染毒后小鼠肝组织病理损伤,检测血清中ALT及炎症因子IL-6、MCP-1和TNF-α表达水平变化。结果通过观察小鼠存活时间,确定腹腔注射最佳染毒剂量为LPS(2.5 mg/kg)/D-GalN(0.3 g/kg);小鼠染毒后肝组织呈进程性病变,最终发展为肝脏弥漫性坏死,肝细胞核崩解。与对照组相比,血清ALT显著升高(P0.001),IL-6、MCP-1、TNF-α均在1 h后达到最高水平(P0.001),然后持续下降。结论成功建立LPS/D-GaIN诱导小鼠急性肝损伤模型,为探索急性肝损伤的致病机制以及药物干预治疗提供有效的动物模型。