沙门氏菌的分子分型方法

沙门氏菌是一类危害人和动物健康的重要致病菌,是引起食物中毒的最常见病原菌之一.本文对目前常用的3种分子分型方法脉冲场凝胶电泳(Pulsed-field gel electrophoresis,PFGE),多位点序列分析(Multi-locus sequence analysis,MLST)及多位点可变数串联重复分析(Multiple-locus variable number tandem repeats analysis,MLVA)在沙门氏菌分子分型的应用做了阐述和比较,为沙门氏菌分型研究提供一定的参考.     

鱼源无乳链球菌的血清型及分子分型研究

为了解不同鱼源无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)分子分型特征, 分析菌株之间的相关性和同源性, 研究在采用S. agalactiae特异性cfb基因对分离菌株鉴定的基础上, 对26株不同鱼源S. agalactiae进行了荚膜多糖血清型(CPS)多重PCR鉴定, 同时采用多位点序列分型(MLST)和脉冲场凝胶电泳(PFGE)进行分子特征比较与同源性分析。结果显示, 26株菌CPS型存在Ia (n=22)和III型(n=4)两种类型, 其中黄河裸裂尻鱼源和罗非鱼源菌株均为Ia血清型, 齐口裂腹鱼源菌株存在Ia (n=2)和III (n=4)型两种CPS型; 多位点序列分型共得到3种STs序列型(ST-891、ST-103、ST-19), 其中黄河裸裂尻鱼源和罗非鱼源菌株均为新的序列型ST-891, 齐口裂腹鱼源菌株存在ST-103和ST-19两种STs型; PFGE聚类分析可分为16个PFGE谱型(A-P), 其中优势带型为P型(n=9)。相同荚膜多糖血清型—MLST分型菌株在PFGE带型中呈现高度聚集。CPS分型与MLST分型、PFGE分型有很好的相关性, 而CPS型、STs序列型、PFGE带型与宿主的来源没有明显的相关性。不同鱼源S. agalactiae分子特征的相似性, 提示其存在交叉感染的可能性, 而齐口裂腹鱼源S. agalactiae分子特征的多样性, 提示其存在遗传变异的情况。     

19群肺炎链球菌国家标准菌株分子特征分析及在菌株质量控制中的应用

目的明确19群肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)国家标准菌株的分子特征,为完善中国肺炎链球菌国家标准菌株的质量标准提供依据。方法在传统肺炎链球菌菌种检定方法的基础上,应用16S rRNA基因分析、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)血清分型、多位点序列分型(multilocus sequence type,MLST)和脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis,PFGE)分型等多种分子生物学质控方法,对来源于中国医学细菌保藏管理中心的20株19群肺炎链球菌国家标准菌株进行分析。结果 20株19群肺炎链球菌的16S rRNA基因序列与肺炎链球菌模式株NCTC 7465的16S rRNA基因序列的相似性在99.64%～100%之间,碱基差异0～5 bp。PCR血清分型结果表明:11株19F型菌株均检测到大小为304 bp的19F型特异性扩增条带,6株19A型菌株均检测到大小为478 bp的19A型特异性扩增条带,PCR血清分型结果与血清凝集试验结果一致。MLST分型结果表明,相同血清型的菌株可以具有不同的序列型(sequence type,ST)。共获得12个ST型,其中6个ST型(10496、10497、10501、10502、10503和10509)为首次报道。PFGE分型结果显示:各型别菌株各具有其特征性PFGE带型(9～17条带),相同血清型或ST型菌株可能具有不同的PFGE带型。共存在18种不同的PFGE带型,其中19F型和19A型菌株中各有一对菌株的ST型和PFGE图谱完全一致。菌株的传代稳定性考察结果显示:在25代以内31708菌株的PFGE带型未发生变化,遗传特征是稳定的。结论 16S rRNA基因分析、PCR血清分型、MLST分型和PFGE分型等分子生物学方法应用于中国肺炎链球菌国家标准菌株的质量控制,可获得更加全面的肺炎链球菌标准菌株身份信息数据(包括序列、PCR扩增片段、序列型、图谱等),为进一步完善中国肺炎链球菌国家标准菌株的质量标准提供依据和数据支撑。     

细菌分型方法研究进展

细菌分型是用于研究不同菌株之间关系的一种手段。对细菌进行分型,有助于病原菌和污染菌的定性和溯源,从而有助于监测传染病的暴发及监控食品污染的发生。近年来各种分型技术取得了长足发展,本文对目前常用的基于脉冲场凝胶电泳(PFGE)、限制性片段长度多态性(RFLP)、扩增片段长度多态性(AFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、规律成簇的间隔回文重复序列分型(CRISPR)、多位点序列分型(MLST)、全基因组测序分型(WGS)、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)等技术的细菌分型方法的原理、应用及优缺点进行了综述。     

分子分型技术用于流脑疫情的同源性分析

目的应用多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MLST)技术和脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)技术对大连市2014年4月同一工地两起流脑疫情得到的脑膜炎奈瑟氏菌株进行分子分型图谱分析,了解各菌株之间的亲缘关系。方法对病例的脑脊液标本进行脑膜炎奈瑟菌PCR分群,对另一病例和所有密切接触者分离菌株进行多位点序列分型(MLST)试验和脉冲场凝胶电泳(PFGE)鉴定实验。结果疑似病例标本PCR结果为脑膜炎奈瑟氏菌A群阳性,另一病例和所有密切接触者分离到的菌株PFGE图谱基本相同,表明来自同一克隆系。多位点序列分析结果为ST7。结论两起疫情分离到的菌株型别之间具有高度的同源性,该病原菌类型为ST7的A群脑膜炎奈瑟氏菌。     

沙门氏菌CRISPR位点的结构特征比较

成簇规律间隔的短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR),是存在于多数细菌和古菌中的遗传结构,能够有效防御外源DNA的入侵(质粒、噬菌体等),进而防御外源基因的水平转移。【目的】本研究以沙门氏菌属中常见的鸡伤寒沙门氏菌(Salmonella gallinarum)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)以及肠炎沙门氏菌(salmonella enteritidis)等30个菌株为研究对象。探索CRISPR位点在不同沙门氏菌种中的结构差异。【方法】通过生物信息学的方法比较间隔序列与插入序列的同源性以及CRISPR位点与质粒数量关系。【结果】30株沙门氏菌中均存在CRISPR结构,包括CRISPR位点61个以及可疑位点12个。重复序列和cas1基因均不能作为这4类细菌的分类依据。【结论】虽然我们发现CRISPR位点数量与间隔区数量和质粒数量之间均不存在统计学关系,但间隔序列整合子、耐药基因等移动遗传原件具有一定的同源性,说明沙门氏菌在进化过程中不断受外源基因的侵袭。     

用MLVA技术和多重PCR对犬种布氏菌基因分型

目的：对犬种布氏菌的遗传关系进行不同分子分型方法的对比研究,为犬布病分子流行病溯源提供有效方法。方法：采用多重PCR和多位点可变数量串联重复序列分析（MLVA）方法对24株犬种布氏菌的遗传关系进行比较研究。结果：多重PCR只鉴定出1株犬种布氏菌,其余23株均鉴定为猪种鲁氏菌,但不能鉴定型别;MLVA方法对已鉴定为猪种的布氏菌仍可再细分为型,87%（20/23）为猪3型,13%（3/20）为猪1型。结论：MLVA可以对布氏菌种（生物型）进行基因分型鉴定,可以作为传统表型鉴定方法的补充。     

南方食品中沙门氏菌污染调查及分型

摘要:【目的】系统调查我国南方代表性地区食品中沙门氏菌污染情况,并对分离株进行血清分型和肠杆菌基因间重复共有序列聚合酶链式反应(Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus Polymerase Chain Reaction,ERIC-PCR)分型研究,为溯源和控制食品中沙门氏菌的污染提供数据。【方法】采用定性法和最大可能数(Most Probable Number,MPN)法对七大类食品(肉与肉制品、水产品、速冻食品、熟食、蔬菜、乳制品和食用菌)中的沙门氏菌进行检测。利用血清分型和分子分型确定南方沙门氏菌血清型的分布和优势血清型,研究分离株的遗传多样性。【结果】从400份食品样品共检出75 份沙门氏菌阳性样品,污染率为18.8%(75/400)。其中,97.3%(73/75)的阳性样品污染水平均低于10 MPN/g。对93株分离株进行血清分型,分属9个群、29种血清型。优势血清型为德尔卑沙门氏菌(Salmonella Derby)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)。利用ERIC-PCR对96株沙门氏菌(包括93株分离株和3株标准株)进行分型研究发现,在相似系数为0.75时可分为15个聚类簇,56种型别,分离株的基因型别呈现多样性。【结论】南 方食品中沙门氏菌的污染率较高,但污染水平低。S. Derby和S. Typhimurium为优势血清型。初步建立了沙门氏菌ERIC-PCR指纹图谱数据库,南方食品中沙门氏菌的血清型和基因型呈现多样性。     

炭疽芽胞杆菌中CRISPR位点

【目的】考察炭疽芽胞杆菌中规律成簇的间隔短回文序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)位点多态性情况及基于CRISPR位点多态性的分子分型方法是否在炭疽芽胞杆菌分型中适用。【方法】下载NCBI数据库中6株炭疽芽胞杆菌基因组并截取其中CRISPR位点片段序列。根据炭疽芽胞杆菌内CRISPR位点信息,设计相关引物,以193株炭疽芽胞杆菌基因组为模板PCR扩增CRISPR位点片段,测序。本地Blast比对截取序列及测序结果,查看CRISPR位点在炭疽芽胞杆菌中的多态性情况,并比较炭疽芽胞杆菌与蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌内CRISPR位点情况。【结果】炭疽芽胞杆菌内CRISPR位点不存在多态性。【结论】基于CRISPR位点多态性的分子分型方法不适用于炭疽芽胞杆菌分型,但可以用于区分炭疽芽胞杆菌与蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌。     

新生儿及产妇感染单核细胞增生李斯特菌分离株的血清型、耐药性及分子特征研究

为探讨广西南宁地区新生儿及产妇感染的单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes, Lm)的血清型、药物敏感性及其分子流行病学特征,本研究回顾性收集2015-2017年广西壮族自治区妇幼保健院新生儿科及产科送检标本中分离的Lm,对其进行体外药物敏感性检测、血清学分型以及多位点序列分型(multilocus sequence typing, MLST)分析菌株间的同源性;同时分析患儿及其母亲的临床特征及危险因素。结果显示,广西南宁地区新生儿感染Lm发病率较低,2015-2017年发病率为0.091‰;所有分离的Lm分属4b(83.3%)和1/2a(16.7%)2个血清型;药物敏感性试验结果显示,Lm对青霉素、氨苄西林、复方新诺明及美罗培南均100%敏感,暂未发现耐药菌株;MLST分型共获得2个序列型(sequence types,ST),以ST­1型(83.3%)为主。其中分离自同一新生儿患者(Case 2)外周血(Lm2)、耳拭子(Lm3)及其母亲羊水(Lm4)、宫颈分泌物(Lm5)的4株菌具有相同的血清型、药物敏感性表型以及MLST分型。感染Lm的患儿主要表现为发热、肺炎、发绀、败血症及脑膜炎;而产妇感染则具有非特异性的临床特征。结果提示,广西南宁地区存在的Lm菌株为致病性较强的4b、1/2a血清型菌株;Lm可通过母婴垂直传播引起新生儿感染。因此,临床医师应重视孕产妇及新生儿Lm病原学检查、早期诊断和及时合理地使用抗生素预防、治疗,从而减少Lm引起的母婴感染。     

海南岛光滑假丝酵母菌多位点序列分型研究

目的:对海南省光滑假丝酵母菌临床分离株进行基因分型研究,了解菌株的遗传特征及遗传进化关系.方法:采用多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MLST)技术,对临床分离的25株光滑假丝酵母菌6个管家基因序列进行测定;并将各个基因的序列与MLST数据库中储存的序列比对,确定其等位基因谱型及菌株序列型(STs).结果:25株临床分离的光滑假丝酵母菌通过MLST产生ST7、ST19、ST15、ST26、ST45共5个不同的序列型,其中ST7为主要序列型.结论:海南省光滑假丝酵母菌感染型别丰富,具有多样性;MLST分型具有较高的分辨力,可用于流行病学和菌群多态性的研究.     

不同毒力差异基因型的新生隐球菌MLST分型及交配型鉴定研究

目的：了解及比较两组毒力差异明显的新生隐球菌格鲁比变种的多位点序列分型（MLST）的特点并进行交配型鉴定。方法采用多位点序列分型（MLST）的方法,设计7个看家基因（CAP59,GPD1,LAC1,PLB1,SOD1,URA5和IGS1）的引物,扩增并分析来源分别为环境和临床的各10株新生隐球菌格鲁比变种的基因型,并鉴定实验菌株交配型,与多位点微卫星分型（MLMT）结果对比,比较不同基因分型方法在分类中的稳定性和可靠性。结果在微卫星分型中为MLMT-36的10株环境分离株,MLST分型为ST-15,而在微卫星分型中为MLMT-13型的10株临床分离株,MLST分型为ST-32,所有菌株交配型均为MAT-α。结论MLST分型结果与MLMT分型结果高度一致,提示以上两种分子分型技术在真菌分类鉴定研究中可显示对于其分离背景及进化来源的高分辨率及稳定性。     

乳酸菌微进化的研究进展

摘要:乳酸菌是食品工业中重要的微生物,乳酸菌微进化研究有助于深入解析其生物学功能与机制。随着分子生物学的发展,多位点序列分型(Multi-locus Sequence Typing,MLST)及基因组重测序(Whole-genome resequencing)等技术手段应运而生,使得从分子水平上阐述乳酸菌的系统发育和种群进化关系成为可能。MLST已被广泛用于乳酸菌遗传多样性和种群结构等微进化研究中,近期,测序成本的锐减使全基因组测序技术在乳酸菌微进化研究中的优势日益突显。本文对乳酸菌微进化的理论基础、研究方法和意义进行了阐述,并介绍了全基因组测序技术在乳酸菌微进化方面的应用,旨在为乳酸菌微进化分析研究提供新思路。     

基于多位点序列分型方法的于桥水库微囊藻遗传多样性分析

为了研究天津于桥水库微囊藻(Microcystis)的遗传多样性及其系统发育关系, 将分离自于桥水库的10株微囊藻的7个管家基因(ftsZ、glnA、gltX、gyrB、pgi、recA和tpi)构建了微囊藻的多位点序列分型(MLST)基因库, 与20个鄱阳湖序列型(STs)和237个日本湖泊的序列型进行比对, 结果发现于桥水库的STs呈独立分支, 说明相对于其他地区的藻株, 于桥水库微囊藻株具有共同祖先。MLST的结果显示本研究10个藻株具有较高的遗传多样性, 平均期望杂合度H值为0.938。基于序列类型构建的系统发育树显示, MLST可以有更精细的分辨率, 有成为种群分子标记的潜在可能性。     

脑膜炎奈瑟菌分子分型方法的进展

目前,脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis,Nm)分型方法可分为免疫学为基础的传统分型方法和分子生物学分型方法,前者包括血清分群和单克隆分型,后者包括脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)、多位点测序分型(multi locus sequence typing,MLST),核糖体分型(ribotyping),随机扩增多态性DNA分型(randomly amplified polymorphic DNA,RAPD)等.     

2007-2008陕西部分零售畜禽肉沙门氏菌血清型和基因型

【目的】研究359株在2007-2008年分离于陕西部分地区零售畜禽肉中沙门氏菌的血清型和基因型,为确保食品安全提供依据。【方法】使用WHO指定的泰国SA公司的沙门氏菌诊断血清,采用玻片凝集法测定沙门氏菌的血清型。使用美国疾病预防控制中心推荐的脉冲场凝胶电泳方法确定沙门氏菌的DNA酶切图谱,BioNumerics软件分析电泳结果,确定沙门氏菌的基因型。【结果】359株沙门氏菌共检出24个血清型,以肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)、鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium)、舒卜拉沙门氏菌(S.Shubra)、印第安纳沙门氏菌(S.Indiana)和德尔卑沙门氏菌(S.Derby)等为主,不常见血清型有圣保罗沙门氏菌(Salmonella Saintpaul)、里地乌沙门氏菌(S.Rideau)、田纳西沙门氏菌(S.Tennessee)、汤卜逊沙门氏菌(S.Thompson)、加里玛沙门氏菌(S.Galiema)、卡罗尔沙门氏菌(S.Kallo)、沙门氏菌Ⅲa(S.Ⅲa)、罗森沙门氏菌(S.Rissen)和布兰卡斯特沙门氏菌(S.Brancaster)等。鸡肉中最常见血清型为肠炎沙门氏菌,猪肉和羊肉中以德尔卑沙门氏菌检出率最高,而牛肉中以里地乌沙门氏菌为主。359株沙门氏菌使用XbaⅠ酶切分型后,按照88%的基因同源性,可分为7个大簇。同一血清型的沙门氏菌分型后基本位于同一大簇之中,虽然部分沙门氏菌的血清型不同,但分型后仍表现出较高的基因同源性和相似的基因型。【结论】陕西零售肉沙门氏菌的血清型和基因型表现为多样性的特征。     

肠道沙门菌O:4(B)菌群脉冲场凝胶电泳分子分型

为了明确2010年食源性疾病监测中分离的肠道沙门菌O:4(B)菌群的PFGE分子型别,探讨其多态性及其与分子流行病学关系,我们将分离获得的29株O:4(B)血清型沙门菌进一步鉴定培养,挑取单个菌落增菌,供试菌株基因组DNA用限制性内切酶Xba Ⅰ消化酶切后进行脉冲场凝胶电泳分型,所得结果用Bionumerics5.1软件进行聚类分析.实验结果表明,根据电泳指纹图谱,可将29株肠道沙门菌O:4(B)菌群分为24个PFGE型别,菌株间的相似值在56.31%~100%之间,同一血清型别的沙门菌有多个PFGE型别.脉冲场凝胶电泳对O:4(B)群沙门菌有较高的分型能力,可有效的应用于食物中沙门菌溯源分析及分子流行病学研究.     

血流感染碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的耐药分析及同源性研究

本研究旨在探讨血流感染碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistant Klebsiella pneumonia, CRKP)的耐药特点、分子分型特征和菌株同源性,为CRKP感染的临床诊治和预防控制提供理论参考。收集2015年4月至2018年3月期间就诊于上海市某三甲医院患者血标本分离的肺炎克雷伯菌(KP)非重复菌株,采用VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定仪鉴定细菌并进行药物敏感性试验,共获得51株CRKP。对CRKP菌株使用纸片扩散法或琼脂稀释法进行15种抗菌药物的敏感性试验;采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测碳青霉烯酶基因型;通过脉冲场凝胶电泳和多位点序列分型(MLST)技术分析菌株同源性。结果显示,51株CRKP对检测的15种临床常用抗菌药物呈广泛耐药,对其中的哌拉西林、头孢唑啉、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢呋辛、头孢他啶、头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦和环丙沙星耐药率为100%;对阿米卡星、庆大霉素和复方新诺明的耐药率较高,分别为76.5%、90.2%和62.8%;对替加环素耐药率较低,为3.9%。51株CRKP均检测出blaKPC基因,经测序鉴定为blaKPC-2基因,提示产KPC-2是CRKP对碳青霉烯类耐药的主要机制。MLST检测到4种ST型别,以ST11型为主,共 43株(84.3%),另有ST15型6株(11.8%),ST4845型1株及1株新分型。51株CRKP的PFGE图谱相似性系数在62.9%～100%,可分为19个簇(A-S簇),每簇分别包含1～12个菌株。其中A簇(13.7%)和G簇(23.5%)包含的菌株相对较多,且MLST分型均为ST11型,为优势簇。G簇包含7个型别,G4型为主要克隆菌株。 ST11型为CRKP的主要型别,PFGE分析表明该院存在菌株的克隆传播,应规范抗菌药物使用,同时加强细菌耐药性监测和医院内感染的防控工作。     

中国首株格特隐球菌VGII基因型分离株XH91的分子和表型特征鉴定

【目的】研究我国首次临床分离的一株格特隐球菌VGII基因型菌株(XH91)的分子和表型特征。【方法】对受试株XH91进行血清型的分子鉴定;选取核基因组和线粒体基因组中共16个基因片段进行多位点序列分型;对受试株进行单倍体繁育、同性交配及异性交配能力评价;观察受试株的黑色素生成、荚膜厚度及37℃生长等表型特征。【结果】我国首株格特隐球菌VGII基因型菌株XH91为血清B型;该菌株在多位点序列分型上与温哥华岛致病基因型VGIIb一致;XH91能与a交配型发生交配,产生担孢子,而不能与α交配型发生交配且不具备单倍体繁育能力;XH91的黑色素生成、荚膜厚度及37℃生长等表型特征与参考株无明显差异。【结论】我国首株格特隐球菌VGII基因型菌株XH91在基因型、表型特征上均与温哥华岛VGIIb基因亚型一致,该结果将为我国格特隐球菌VGII基因型的分子流行病学和疾病监控提供重要资料。     

11群肺炎链球菌荚膜多糖合成相关基因的分子生物学研究

目的利用分子生物学方法,研究7株11群肺炎链球菌荚膜多糖合成相关基因(cps loci)。方法根据11群肺炎链球菌荚膜多糖合成相关基因设计合成5对特异性引物,以7株肺炎链球菌基因组DNA作为模板进行PCR扩增,并对扩增产物进行序列测定及基因序列比对,确定其血清型。多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)技术分析7株11群肺炎链球菌序列型(ST)。采用相邻合并分析(neighbour-joining analysis),根据MLST的7个管家基因和cps基因分别绘制系统发育树。结果根据wcw C、gct和wcj E等3个基因产物确定5株原11A型肺炎链球菌为11A型,无11E型;根据wcwR和gct等2个基因产物确定2株原11B型肺炎链球菌为11B型。获得7株不包括4个合成调控基因(wzg、wzh、wzd和wze)的11群肺炎链球菌cps loci,长度为11～12 kb,11A型具有12个开放式阅读框(ORF),11B型具有11个ORF。5株11A型肺炎链球菌部分cps基因序列差异较大; 2株11B型肺炎链球菌部分cps基因序列相似性高于99%。根据MLST分析发现3种新的ST型。根据MLST的7个管家基因绘制的系统发育树和cps基因绘制的系统发育树差异很大。结论从分子水平上确定了11A和11B血清型。获得了5株11A型和2株11B型肺炎链球菌ST型和部分荚膜多糖合成相关基因(cps loci),完善了11群肺炎链球菌的菌种档案。