心肌细胞兴奋收缩耦联的分子机制

肌细胞兴奋时,动作电位通过电压门控钙通道激活肌质网钙释放,由此引发的细胞内钙离子的瞬时升高驱动细胞收缩,这个过程叫做兴奋收缩耦联．21世纪以来,随着钙成像技术和分子细胞生物学技术的联合应用,心肌兴奋收缩耦联的分子机制逐步阐明．本文结合本实验室的相关研究,系统总结该领域的前沿进展,包括钙释放通道的分子性质、电压门控钙通道激活肌质网钙释放通道的动力学过程、生理调控以及病理变化．     

兴奋-收缩偶联中DHPR与RyR的相互作用

兴奋-收缩偶联（E—C coupling）依赖纽胞膜二氢吡啶受体（DHPR）／L型电压门控Ca^2＋通道和肌浆网兰诺定受体（RyR）／Ca^2＋释放通道的相互作用。在骨骼肌细胞中,DHPR与RyRl在结构上二机械偶联,不依赖细胞外Ca^2＋即可激活RyRl;在心肌细胞中,去极化激活DHPR,细胞外Ca^2＋内流,内流的Ca^2＋通过钙诱导钙释放（CICR）机制激活RyR2。最近的研究表明,DHPR与RyR之间的信号转导通常是双向的。DHPR与RyR机械和化学的双向偶联机制调节这两种Ca^2＋通道的效率、精确度和活性。     

心肌肥厚中L-型钙通道与ryanodine受体分子间信号耦联的衰退

心脏压力负荷导致心肌肥厚的过程是心衰发生的关键环节。已有研究表明,控制心脏收缩的细胞钙致钙释放过程在心肌肥厚及心衰状态下发生缺损,但分子机制尚未阐明。我们以主动脉结扎手术建立压力负荷的大鼠心肌肥厚模型：实验组分为假手术组、代偿性肥厚组（CHT）和失代偿性肥厚组（DHT）,以松钳一共聚焦成像技术研究单个L-型钙通道（LCC）与ryanodine受体（RyR）间的钙信号耦联。我们发现DHT中LCC—RyR分子耦联潜伏期延长49％,耦联成功率降低47％,失败概率提高72％,证明DHT进入了一种“分子间衰退”状态。出人意料的是,心功能正常的CHT也发生分子间衰退,并与锚定肌质网与细胞膜的junctophilin蛋白表达下降有关,表明分子间耦联衰退在细胞功能变化显现之前已经潜性地发生。与此一致,细胞兴奋期钙释放同步性降低,但钙释放总量和细胞钙瞬变在CHT并无变化。这些结果提示,在一个我们称为“稳定余量”（stability margin）的范围内,分子间耦联衰退不会影响细胞兴奋收缩耦联能力,只有分子间耦联衰退超出稳定余量,心衰才会发生。潜性的分子间耦联衰退的发现对早期防治心衰有重要意义。     

β-肾上腺素能受体调控心肌细胞钙释放的分子机制

β-肾上腺素能受体（βAR）是最经典的G蛋白耦联受体。在心室肌细胞中,βAR可以提高细胞膜L-型钙通道（LCC）介导的钙内流的幅度和同步性,通过钙致钙释放机制触发肌质网（SR）更强的钙释放活动,从而起到调节心脏收缩能力的作用。然而,目前仍不清楚β-蛋白激酶A（PKA）信号通路如何直接调控肌质网钙释放通道ryanodine受体（RyR）的功能,该领域的研究结果存在很大争议。本文使用特殊的单通道钙成像技术,通过去极化方法激活单个LCC产生钙小星,记录触发的RyR钙火花。结果表明,在βAR激动剂异丙肾上腺素（1μM）作用20分钟内,单个LCC触发的钙火花幅度显著上升,且该效应不依赖于LCC单通道钙电流的变化;βAR激动下钙火花的钙释放电流幅度与肌质网钙储量的比值显著提高,表明βAR信号动员了更多的RyR通道参与同步钙释放活动;βAR激动下钙小星触发钙火花的耦联潜伏期时间缩短,成功率上升,表明βAR信号通路增强了LCC—RyR的分子间耦联效率。上述效应不依赖BAR引起的在肌质网钙储量上升,且能够被PKA抑制剂Rp-β-CPT-cAMP（100μM）和H89（10μM）消除。上述结果证明,βAR—PKA信号能够提高RvR对LCC单通道电流的响应速率和同步性。由此揭示的交感神经调节心脏功能的分子机制,将为进一步研究心脏疾病下βhR信号的异常变化奠定基础。     

心肌细胞横管-肌质网耦联与钙信号调控

心肌细胞的兴奋沿横管传入细胞深处并激活L型钙通道,进而通过钙致钙释放机制激活肌质网ryanodine受体钙释放通道,由此产生的钙火花叠加成为细胞钙瞬变,引发心肌细胞同步化收缩.β1型肾上腺素受体介导的广域cAMP信号通过磷酸化L型钙通道、ryanodine受体、肌质网受磷蛋白,分别上调钙内流、钙释放和肌质网钙泵的钙回收...     

心肌细胞膜与肌质网膜的结构功能耦联及其病理重塑机制

心脏的收缩功能依赖心肌细胞膜（包括横管）与肌质网的结构耦联以及其中L型钙通道与肌质网钙释放通道之间的钙致钙释放过程。在一些病理条件下,细胞膜与肌质网的耦联结构发生重塑,钙致钙释放机制受损,心肌细胞收缩力下降。其中,junctophilin-2等蛋白分子表达量减少是心力衰竭疾病中心肌细胞收缩能力下降的关键因素。     

血管平滑肌收缩的Ca^2＋信号调节机制

血管平滑肌细胞内Ca^2＋的浓度（[Ca^2＋]i）的变化及胞内收缩蛋白对Ca^2＋的敏感性是影响血管紧张的主要因素。研究表明细胞内Ca^2＋浓度的变化在血管平滑肌细胞的激活中发挥重要作用。在静息状态,细胞内的Ca^2＋浓度主要受膜电位的调节,同时,[Ca^2＋]i也可反馈调节膜电位。在平滑肌细胞内存在多种[Ca^2＋]i调节机制。本文概述了这些机制在调节血管平滑肌紧张中的作用,主要包括：[Ca^2＋]i在血管平滑肌收缩中的作用;环二磷酸腺苷（cADPR）在调节Ca^2＋释放中的作用;cADPR介导的肉桂碱受体的激活在调节平滑肌紧张度中的作用;血管平滑肌细胞的Ca^2＋闪烁和细胞膜Ca^2＋敏感性钾通道的激活;[Ca^2＋]i与膜电位之间的相互作用等。     

Ca2+对骨骼肌钙释放通道的调节

钙释放通道（calcium release channel）又称Ryanodine受体（RyR）,是细胞内质网膜上介导细胞内钙信号转导的离子通道。RyR1在骨骼肌细胞的兴奋-收缩偶联过程中起重要作用,是肌质网快速释放Ca^2＋的通道。许多调节因素,如一些内源性蛋白（FK结合蛋白、钙调素、钙结合蛋白）和一些离子（Ca^2＋、Mg^2＋）,通过不同的作用位点与RyR1结合,调控RyR1的结构与功能。研究表明,Ca^2＋是众多调节RyR1因素中的核心成分和前提条件,其对RyR1的结构与功能有重要的调控作用。     

库容性Ca2+内流参与ACh诱导的大鼠远端结肠平滑肌收缩

应用生物换能技术和Ca^2＋通道特异性阻断剂观察并记录大鼠离体远端结肠平滑肌收缩张力的变化,分析库容性Ca^2＋内流（capacitative Ca^2＋ entry,CCE）是否与ACh诱导的离体远端结肠平滑肌收缩反应有关。结果表明,以无钙的Krebs液灌流或应用EGTA螯合细胞外Ca^2＋后,高K^＋及ACh引起的远端结肠平滑肌收缩几乎完全消失。电压操纵性Ca^2＋通道阻断剂verapamil也能减弱高K^＋及ACh引起的远端结肠平滑肌收缩,其减弱的程度分别为74％和41％。在无钙的Krebs液中,5μmol／LACh可引起离体肠管瞬时性收缩,这是由肌质网（sarcoplasmic reticulum,SR）释放钙所致：然后加入10μmol／L阿托品（atropine）,并在此基础上恢复细胞外Ca^2＋（2．5mmol／L）,结肠平滑肌则出现持续性收缩,待收缩反应达峰值时,加入5μmol／L verapamil,收缩无明显变化,且该收缩反应对钙库操纵性通道（store-operated Ca^2＋ channel,socc）阻断剂La^3＋敏感,20,50和100μmol／L的La^3＋使上述收缩张力分别降低15％,23％和36％,且呈浓度依赖性,但对Cd^2＋不敏感。研究结果提示,细胞外Ca^2＋内流对高K^＋及ACh介导的离体远端结肠平滑肌持续性收缩是必需的,由ACh诱导的远端结肠平滑肌收缩至少包括SR释放钙引起的短暂性收缩及受体操纵性Ca^2＋通道（receptor-operated Ca^2＋ channel,ROCC）、电压操纵性Ca^2＋通道（voltage-operated Ca^2＋ channel,VOCC）和CCE介导的胞外Ca^2＋ 内流等途径。这将从通道水平进一步分析消化管平滑肌收缩的机制和特征,亦将为预防和控制因胃肠动力紊乱所致的消化管疾病寻求有针对性的药物干预和治疗提供理论依据。     

钙离子，一个新的第一信使？

钙离子（Ca^2＋）是神经系统中广泛存在的一种第二信使分子。当第一信使激活细胞膜上的受体或离子通道后,可引起细胞内Ca^2＋浓度的升高,从而导致发生一系列的下游反应。然而,最近Vizard等发现了Ca^2＋的一种新功能——作为第一信使调节神经细胞轴突和树突的生长。     

猪冠状动脉平滑肌细胞的自发瞬时外向电流的特性

自发瞬时外向电流（spontaneous transient outward currents,STOCs）在小动脉的肌源性调节中起着非常重要的作用。本文应用穿孔膜片钳技术记录了猪冠状动脉平滑肌细胞上的STOCs,研究了其基本特性以及调节。结果显示：STOCs有明显的电压依赖性和钙依赖性,其频率和幅度具有变异性。STOCs可以随机叠加在阶跃刺激方案和斜坡刺激方案引出的全细胞钾电流上。STOCs可被大电导钙激活钾（large-conductance Ca^2＋-activated potassium,BKCa）通道的特异性阻断剂ChTX、螯合胞外钙离子和50μmol／L ryanodine完全抑制。钙离子载体A23187可以明显增加STOCs的幅度和频率;而L型钙通道阻断剂verapamil和CdCl2对STOCs的影响很小。咖啡因使STOCs瞬时爆发性增加,然后抑制。钠离子载体可明显增加STOCs的频率;钠钙交换体选择性抑制剂KB．R7943可明显抑制STOCs。由此可以认为STOCs是BKCa通道介导的。STOCs的产生和激活依赖于经钠钙交换的钙内流和经肌浆网ryanodine受体介导的钙释放,钠钙交换可能决定钙库重载,而细胞膜下肌浆网的胞内钙释放（钙火花）所致的局部钙浓度瞬时增加激活与其相邻的BKCa通道,产生STOCs。     

钙离子:进入细胞浆的途径与血管平滑肌收缩机制

血管平滑肌收缩所需的钙离子源于细胞外流入和细胞内释放。钙流入途径主要有膜电位依赖式和与受体耦联的钙通道。释放钙离子机制受除极IP_3、cIP_3和钙离子作用而激发。进入细胞浆的钙离子与钙受体蛋白结合而引起收缩。血管平滑肌没有肌钙蛋白C,由钙调蛋白或Leiotonin C代之。钙调蛋白通过使肌球蛋白磷酸化;而Leiotonin C则通过直接激活肌动蛋白,引起血管收缩。     

突触后钙通路有助于视锥与L型水平细胞间的突触可塑性

我们实验室以前发现,视网膜视锥与亮度型水平细胞（luminosity—type horizontal cell,LHC）之间的突触传递效率具有可塑性。重复性刺激红敏视锥增加了LHC对红光的超极化反应幅度,而且这种增强作用是可逆的。在本文中,我们运用细胞内记录技术和药理学分析的方法来考察重复性红光刺激引起的反应增强的可能机制。当通过胞内注射Ca^2＋的螯合剂EGTA来降低LHC内的Ca^2＋浓度后,重复性红光引起的反应增强被抑制,提示突触后钙信号是反应增强的一个重要因素。另外,反应增强现象还可以被钙离子通透的AMPA受体（Ca^2＋-permeable AMPA receptor,CP-AMPAR）的拈抗剂阻断,说明通过钙离子通透的谷氨酸受体内流的Ca^2＋与胞内Ca^2＋浓度的改变有关。进一步发现,胞外灌流ryanodine或caffeine也可以消除反应增强现象,说明由钙诱导的钙释放（calcium—induced calcium release,CICR）引起的钙信号可能也参与了反应增强现象的产生。结果提示,CICR和CP—AMPAR与重复性红光刺激引起的LHC对红光的反应增强有关。     

钙火花研究进展与瞻望

钙离子是最广泛而又最重要的细胞内第二信使。自1993年以来,钙火花等一系列钙信号基本单元相继发现,揭示了细胞钙信号转导的数字-模拟二元特征：纳米-微米尺度上短暂的钙信号事件（数字系统）随机叠加于连续的全细胞钙信号（模拟系统）背景中。数字模式的微区域钙信号赋予细胞钙信号在时间、空间、幅度上多尺度多层次的精细结构。对钙火花激活机制、协同机制、终止机制等方面的研究,为钙释放通道阵列的门控及调节提出了新的见解和问题。钙火花等对于高域值钙依赖性过程（如肌细胞兴奋-收缩耦联、细胞兴奋性和神经细胞分泌）的激活和时空调控具有特别重要的生理和病理意义。钙信号“激-模二元性”的研究可望进一步揭示细胞钙信号的简单性与复杂性的统一。     

青蛙心肌细胞膜在调节肌浆钙离子浓度中所起作用的定量考虑

在骨胳肌兴奋-收缩耦联过程中,肌浆钙离子浓度主要由肌浆网系调节。青蛙心肌细胞的肌浆网系不发达,没有横管,且细胞直径很小,因此肌浆钙离子浓度很可能由发生在肌膜上的过程调节。本文从定量角度验证这一设想的可能性。假定青蛙心肌细胞兴奋时钙离子顺浓度差从细胞外跨膜扩散入细胞使肌浆钙浓度升高,又经肌膜上类似载体作用的主动过程将钙离子排出细胞,由此计算静息蛙心肌在某一频率的重复刺激下肌浆钙离子浓度随刺激次数的变化以及对不同刺激频率当收缩张力达稳态时肌浆内钙浓度值。利用肌肉稳态收缩张力和细胞内钙离子浓度之间已知的单值关系可以看到,计算结果同实验记录的蛙心肌稳态张力与刺激频率间的“阶梯”关系符合得很好,说明青蛙心肌细胞膜在调节肌浆钙离子浓度中起决定作用这一想法从定量角度考虑也完全是可能的.     

酿酒酵母细胞中钙离子信号传导途径的研究进展

酿酒酵母（SaccharomycescP增v括fdP）细胞可以通过ca2＋／钙调磷酸酶信号途径来应对许多外界环境胁迫。在交配信息素、盐或者其他环境压力存在的条件下,钙离子会通过细胞质膜上的未鉴定的钙转运蛋白x和M或者由Cchl和Midl组成的钙通道进入细胞质。胞质内钙离子浓度的增加会激活细胞质里的钙调磷酸酶（calcineurin）。钙调磷酸酶的一个非常重要的作用是去磷酸化细胞质内的转录因子Crzl,造成它快速地从细胞质转移到细胞核,从而诱导包括液泡膜上钙泵蛋白基因PMCl以及内质网膜和高尔基体膜上钙泵蛋白基因尸脚,在内的目标基因的表达。这两个钙泵蛋白和液泡膜上的Ca2＋／H＋交换蛋白Vcxl一起作用,将细胞质内的钙离子浓度控制在50～200nmol／L的正常生理浓度内．使细胞能够正常生长。该综述主要论述了酿酒酵母细胞内Ca2＋／钙调磷酸酶信号途径的最新研究进展。     

钙激活氯离子通道对大鼠肺动脉张力的调节作用

目的：研究钙激活氯离子通道及其通道阻断剂尼氟灭酸（niflumic acid,NFA）、indaryloxyacetic acid（IAA-94）在苯福林（phenylephrine,PE）引起的肺动脉收缩中的作用。方法：常规离体血管灌流法检测肺动脉环张力;采用钙荧光探针（Fura-2／AM）负载急性酶分离法（胶原酶Ⅰ型和木瓜蛋白酶）获得的大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）,观察NFA和IAA-94对PE诱导的PASMCs胞浆游离钙离子浓度（[Ca^2＋]i）的影响,用荧光分光光度计法检测[Ca^2＋]i。结果：钙激活氯离子通道阻断剂NFA和IAA-94可以舒张PE引起的肺动脉环收缩;NFA和IAA-94对KCl引起的血管收缩无影响;PE可以引起[Ca^2＋]i升高,NFA和IAA-94对PE诱导[Ca^2＋]i升高无影响。结论：钙激活氯离子通道在生理状态下与血管活性药（PE）引起的肺动脉张力变化有关,这为研究其在低氧肺血管收缩中的作用提供了新的线索。     

成年大鼠心肌细胞分离培养及兴奋-收缩耦联表征

目的：比较两种细胞分离液分离成年大鼠心肌细胞,进一步表征成年大鼠心室肌细胞兴奋-收缩耦联。方法 Langendorff装置进行主动脉逆流灌流,分别用两种细胞分离液分离成年大鼠心肌细胞,无血清培养并进行腺病毒感染。显微镜下观察单个心肌细胞的形态学特点,荧光显微镜下检测病毒感染。采用IonOptix仪器检测心肌细胞肌节收缩-舒张指标以及心肌细胞钙离子摄入-排出指标。结果两种分离液均可获得70％横纹清晰的长杆状心肌细胞,培养可存活7 d以上。腺病毒感染48 h,绿色荧光蛋白持续表达7 d以上。分离液一获得的心肌细胞不能很好地随电场刺激产生收缩,分离液二获得的细胞可用于检测兴奋-收缩耦联特性,心肌细胞肌节缩短分数为11.61％±2.15％,舒张时间为（0.177±0.031） s,钙瞬变幅度为30.79％±9.74％,钙瞬变衰减时间为（0.300±0.074） s。结论两种分离液均可用于分离和培养成年大鼠心肌细胞,并用于腺病毒转染等长时程研究。分离液二更适用于检测成年大鼠心肌细胞的兴奋-收缩耦联特性。     

持续癫痫样放电导致海马神经元钙离子动力学变化的研究

目的：研究低镁介质致痫的培养海马神经元癫痫模型中神经元内游离钙离子（[Ca^2＋]i）的时空分布及其动力学改变,以探讨钙离子在癫痫发病过程中的作用。方法：联合应用共聚焦激光扫描显微镜和膜片钳,运用较高时间分辨率动态观察培养海马神经元癫痫模型[Ca^2＋]i和电生理变化,以及化学门控钙离子通道阻滞剂的影响。结果：致痫后海马神经元胞浆和核内游离钙离子迅速上升到（612±65）nmol／L和（620±69）nmol／L水平,NMDA受体阻断剂MK-801（10μmol／L）和非NMDA受体阻断剂NBQX（10μmol／L）可使[Ca^2＋]i的升高明显减少;升高的[Ca^2＋]i恢复有明显的延迟现象,90min和150min癫痫样放电后[Ca^2＋]i恢复的时间分别为（114．8±5．2）和（135．0±22．7）（P〈0．05）。结论：持续的癫痫样放电可导致海马神经元细胞内钙超载,这个效应可被MK-801阻断,化学门控钙离子通道也参与了细胞外Ca^2＋内流的过程。     

非生物逆境胁迫下植物钙信号转导的分子机制

Ca^2＋作为植物细胞中最重要的第二信使,参与植物对许多逆境信号的转导。在非生物逆境条件下,植物细胞质内的钙离子在时间、空间及浓度上会出现特异性变化,即诱发产生钙信号。钙信号再通过其下游的钙结合蛋白进行感受和转导,进而在细胞内引起一系列的生物化学反应以适应或抵制各种逆境胁迫。目前在植物细胞中发现Ca^2＋／CDPK、Ca^2＋／CaM和Ca^2＋／CBL3类钙信号系统,研究表明它们与非生物逆境胁迫信号转导密切相关。本文通过从植物在非生物逆境条件下钙信号的感受、转导到产生适应性和抗性等方面,介绍钙信号转导分子机制的一些研究进展。