β-肾上腺素能受体调控心肌细胞钙释放的分子机制

β-肾上腺素能受体（βAR）是最经典的G蛋白耦联受体。在心室肌细胞中,βAR可以提高细胞膜L-型钙通道（LCC）介导的钙内流的幅度和同步性,通过钙致钙释放机制触发肌质网（SR）更强的钙释放活动,从而起到调节心脏收缩能力的作用。然而,目前仍不清楚β-蛋白激酶A（PKA）信号通路如何直接调控肌质网钙释放通道ryanodine受体（RyR）的功能,该领域的研究结果存在很大争议。本文使用特殊的单通道钙成像技术,通过去极化方法激活单个LCC产生钙小星,记录触发的RyR钙火花。结果表明,在βAR激动剂异丙肾上腺素（1μM）作用20分钟内,单个LCC触发的钙火花幅度显著上升,且该效应不依赖于LCC单通道钙电流的变化;βAR激动下钙火花的钙释放电流幅度与肌质网钙储量的比值显著提高,表明βAR信号动员了更多的RyR通道参与同步钙释放活动;βAR激动下钙小星触发钙火花的耦联潜伏期时间缩短,成功率上升,表明βAR信号通路增强了LCC—RyR的分子间耦联效率。上述效应不依赖BAR引起的在肌质网钙储量上升,且能够被PKA抑制剂Rp-β-CPT-cAMP（100μM）和H89（10μM）消除。上述结果证明,βAR—PKA信号能够提高RvR对LCC单通道电流的响应速率和同步性。由此揭示的交感神经调节心脏功能的分子机制,将为进一步研究心脏疾病下βhR信号的异常变化奠定基础。     

β-肾上腺素受体调控心肌细胞兴奋收缩耦联的分子过程研究

兴奋收缩耦联是肌细胞兴奋期间由动作电位触发肌质网释放钙离子,从而导致收缩的过程。心肌细胞的兴奋收缩耦联是通过“钙致钙释放（Ca^2＋-induced Ca^2＋ release）的机制完成的。兴奋期间,细胞膜电位的去极化导致电压依赖性的L．型钙通道（LCC）开放,细胞外钙离子通过LCC流入细胞,激活了肌质网膜上称为ryanodine受体（RyR）的钙释放通道,后者从肌质网钙库中释放钙离子,使细胞质游离钙浓度迅速上升。细胞质钙浓度的升高一方面启动细胞收缩,另一方面激活了肌质网钙泵和细胞膜钠钙交换,二者分别将钙离子运回肌质网或细胞外,使细胞质钙浓度很快回落,从而完成了一次“钙瞬变（Ca^2＋ transient）”。钙瞬变在每个心动周期发生一次,是直接控制细胞收缩的细胞内信号。     

心肌细胞膜与肌质网膜的结构功能耦联及其病理重塑机制

心脏的收缩功能依赖心肌细胞膜（包括横管）与肌质网的结构耦联以及其中L型钙通道与肌质网钙释放通道之间的钙致钙释放过程。在一些病理条件下,细胞膜与肌质网的耦联结构发生重塑,钙致钙释放机制受损,心肌细胞收缩力下降。其中,junctophilin-2等蛋白分子表达量减少是心力衰竭疾病中心肌细胞收缩能力下降的关键因素。     

心肌细胞兴奋收缩耦联的分子机制

肌细胞兴奋时,动作电位通过电压门控钙通道激活肌质网钙释放,由此引发的细胞内钙离子的瞬时升高驱动细胞收缩,这个过程叫做兴奋收缩耦联．21世纪以来,随着钙成像技术和分子细胞生物学技术的联合应用,心肌兴奋收缩耦联的分子机制逐步阐明．本文结合本实验室的相关研究,系统总结该领域的前沿进展,包括钙释放通道的分子性质、电压门控钙通道激活肌质网钙释放通道的动力学过程、生理调控以及病理变化．     

Ca2+对骨骼肌钙释放通道的调节

钙释放通道（calcium release channel）又称Ryanodine受体（RyR）,是细胞内质网膜上介导细胞内钙信号转导的离子通道。RyR1在骨骼肌细胞的兴奋-收缩偶联过程中起重要作用,是肌质网快速释放Ca^2＋的通道。许多调节因素,如一些内源性蛋白（FK结合蛋白、钙调素、钙结合蛋白）和一些离子（Ca^2＋、Mg^2＋）,通过不同的作用位点与RyR1结合,调控RyR1的结构与功能。研究表明,Ca^2＋是众多调节RyR1因素中的核心成分和前提条件,其对RyR1的结构与功能有重要的调控作用。     

CaMKII在细胞钙稳态维持及心肌保护中作用的研究进展

钙/钙调素依赖性蛋白激酶II(CaMKII)是主要表达于心脏的一种多功能苏氨酸/丝氨酸蛋白激酶,通过磷酸化与Ca2+调节相关的蛋白影响心肌的兴奋收缩耦联及细胞钙稳态.在心肌缺血缺氧等病理条件下,心肌细胞钙离子循环出现异常,CaMKII通过代偿性活性改变起到维持Ca2+稳态及心肌保护效应.深入了解CaMKII对钙循环的调节、在间歇性高海拔缺氧介导的心脏保护及心肌细胞内酸中毒后心肌收缩力恢复过程中的作用机制,具有重要的基础研究及临床应用前景.     

膜耦联的关键分子junctophilin

junctophilin是目前公认的可兴奋细胞的胞膜与内(肌)质网耦联的分子基础.其可能的作用机制是以C端锚定在内(肌)质网上, 通过N端的MORN结构域(MORN motif)与细胞膜相互作用.目前已知该分子在哺乳动物中存在四种亚型,在骨骼肌和心肌分别以Jp-1和Jp-2为主. junctophilin的低表达会导致细胞膜与内(肌)质网脱耦联,从而使心肌和骨骼肌兴奋收缩耦联效率降低, 进而影响收缩能力.目前已发现junctophilin基因突变与心衰等疾病有关,因而junctophilin可能成为针对这些疾病的药物开发新靶点.     

兴奋-收缩偶联中DHPR与RyR的相互作用

兴奋-收缩偶联（E—C coupling）依赖纽胞膜二氢吡啶受体（DHPR）／L型电压门控Ca^2＋通道和肌浆网兰诺定受体（RyR）／Ca^2＋释放通道的相互作用。在骨骼肌细胞中,DHPR与RyRl在结构上二机械偶联,不依赖细胞外Ca^2＋即可激活RyRl;在心肌细胞中,去极化激活DHPR,细胞外Ca^2＋内流,内流的Ca^2＋通过钙诱导钙释放（CICR）机制激活RyR2。最近的研究表明,DHPR与RyR之间的信号转导通常是双向的。DHPR与RyR机械和化学的双向偶联机制调节这两种Ca^2＋通道的效率、精确度和活性。     

心肌肥厚过程中PKC的双刃剑作用

在慢性压力超负荷致心肌肥厚过程中,蛋白激酶C(PKC)是促心肌细胞肥大信号转导通路上的关键分子。心肌中PKC存在多种异构体,其各自的功能与作用尚不清楚。借助于PKC的选择性激动剂与抑制剂、腺病毒转染或转基因模型的研究表明,不同种属心肌中共同拥有的PKC有四种,它们的作用分别为:PKCε、PKCβ与PKCδ均可独立介导心肌细胞肥大,相互间能发挥代偿作用;激活PKCα与PKCβ亦可导致心肌收缩性能降低,相反,激活PKCε可增强心肌收缩性能。PKC的这种既可促进心肌发生代偿性肥厚,又可降低心肌收缩性能而引起失代偿的双重作用,在肥厚心肌向心衰转化过程中值得关注。     

RyR2突变致心律失常机制与转化医学

Ryanodine受体(RyR2)是位于心肌细胞肌浆网上的钙离子释放通道。作为心肌兴奋-收缩偶联的重要组成部分,RyR2功能紊乱在许多心脏疾病的发生和进展中发挥关键作用。儿茶酚胺敏感性多形性室性心动过速(CPVT)与RyR2基因突变相关。现对RyR2致CPVT的分子病理生理机制以及相应的治疗策略进行综述。这些新的治疗策略不仅适用于CPVT,也必将推动其他获得性钙调节紊乱相关性心脏病的研究。     

心肌细胞的钙致钙释放

心肌细胞兴奋－收缩偶联由胞内钙变中介和调控。去极化进进入细胞的少量钙通过钙下释放（ＣＩＣＲ）过程发肌质多（ＳＲ）释放更多的钙,使胞浆钙浓度升高,导致收缩近年来证明,ＳＲ钙放呈梯级特征,提出了局部控制模型,以解释这种现象。钙火花的发现,直观地证硒钙释放单位的存在,进一步支持了局部控制模型。此外,钙释放通道的适应现象,可能是ＣＩＣＲ这一正反馈过程的负调节机制。     

钙火花研究进展与瞻望

钙离子是最广泛而又最重要的细胞内第二信使。自1993年以来,钙火花等一系列钙信号基本单元相继发现,揭示了细胞钙信号转导的数字-模拟二元特征：纳米-微米尺度上短暂的钙信号事件（数字系统）随机叠加于连续的全细胞钙信号（模拟系统）背景中。数字模式的微区域钙信号赋予细胞钙信号在时间、空间、幅度上多尺度多层次的精细结构。对钙火花激活机制、协同机制、终止机制等方面的研究,为钙释放通道阵列的门控及调节提出了新的见解和问题。钙火花等对于高域值钙依赖性过程（如肌细胞兴奋-收缩耦联、细胞兴奋性和神经细胞分泌）的激活和时空调控具有特别重要的生理和病理意义。钙信号“激-模二元性”的研究可望进一步揭示细胞钙信号的简单性与复杂性的统一。     

心衰时心肌收缩蛋白分子基因表达和心肌收缩力的相互关系

目的和方法：本文通过ＤＯＣＡ硅胶管皮下埋入法建立大鼠心力衰竭模型,比较正常与心衰大鼠心肌收缩力的变化。采用ＲＮＡｓｌｏｔｂｌｏｔ杂交从基因转录水平检测正常与心衰大鼠心肌组织中心肌收缩蛋白分子基因αｃａｒｄｉａｃａｃｔｉｎ与αＭＨＣ表达的变化。结果：（１）心衰大鼠心肌收缩力较正常大鼠明显降低;（２）心衰大鼠与正常大鼠相比,心肌收缩蛋白分子基因αｃａｒｄｉａｃａｃｔｉｎ表达水平未见有统计学意义的变化,而αＭＨＣ表达水平呈显著降低（下降２１．３０％,Ｐ＜０．０５）;（３）αＭＨＣｍＲＮＡ的含量与心肌收缩力的大小存在线性正相关（ｒ＝０．４１４３,ｎ＝４３,Ｐ＜０．０５）。结论：αＭＨＣ基因表达水平的下降是心衰时心肌收缩力减退的主要分子基础之一,且与心肌收缩力的大小存在线性正相关     

弱磁场对骨骼肌肌质网钙调控作用的研究

目的：探讨弱磁场对提取的骨骼肌肌质网系（SR）Ca（2＋）转运、钙泵（Ca（2＋）-Mg（2＋）-ATPase）及钙释放通道（RyR）活性的影响,从分子水平和细胞信号系统的角度来解释生物电磁效应。方法：利用动态光谱法检测0.4 mT弱磁场辐照过的SR Ca（2＋）转运、Ca（2＋）-ATPase活性,还原型辅酶（NADH）的氧化初速率和超氧（O_2-）产率,以及用同位素标记方法检测[3H]-Ryanodine与RyR的平衡结合度。结果：弱磁场辐照引起SR的Ca（2＋）摄取功能和Ca（2＋）-ATPase的活性明显下降,Ca（2＋）释放和[3H]-Ryanodine平衡结合度上升,同时上调了NADH的氧化初速率和O_2-的产率。结论：提示0.4 mT弱磁场辐照30 min对SR Ca（2＋）-ATPase活性有明显抑制,对RyR有一定的激活效果。     

E4031对慢性心衰大鼠离体心脏功能和心肌细胞内静息Ca^2＋水平的影响

目的：研究具有钠钙交换（NCX）激动作用的药物E 4031对慢性心衰大鼠离体心脏功能和心肌细胞内静息Ca2＋水平的影响。方法：通过腹主动脉缩窄建立大鼠慢性心力衰竭模型;利用Langendorff装置进行离体心脏灌流,检测大鼠心功能及E 4031对血流动力学指标的影响;急性分离心衰大鼠心肌细胞,与钙荧光指示剂fluo3/AM共同孵育后,用激光共聚焦显微镜系统观察E 4031对心肌细胞内荧光强度的影响。结果：缩窄大鼠腹主动脉12周后,langendorff离体灌流检测显示大鼠心功能明显降低;在灌流液中加入10μmol/L E 4031可以使心衰大鼠心脏左室发展压（LVDP）和左室收缩/舒张最大速率（±dp/dtmax）提高;与正常组和伪手术组相比,心衰大鼠心肌细胞内静息钙荧光强度明显升高,和10μmol/L E 4031共孵育后,心衰大鼠心肌细胞静息钙荧光强度呈现短期先升后降过程,然后在较低的水平保持稳定。结论：E 4031可以增强慢性心衰大鼠离体心功能,可能与其增强心肌细胞膜NCX活动,稳定细胞内Ca2＋水平有关。     

心肌细胞兴奋-收缩偶联的微观机制

心肌细胞的兴奋 收缩偶联 (ECC)本质上是胞膜上的电压门控L 型钙通道 (LCCs)和胞内ryanodine受体 (RyRs)之间通过钙诱导钙释放 (CICR)机制进行沟通进而引发肌细胞收缩的过程。最近的研究进一步揭示了微观水平上LCCs和RyRs之间的信息联系。在钙偶联位点 (couplons)上 ,LCCs因膜去极化而随机开放 ,在局部产生高强度的钙脉冲 (即钙小星 ,Ca2 sparklet) ,作用于邻近肌质网终末池上的RyRs。钙偶联位点通过由钙小星随机激活的RyRs(即钙释放通道 )以钙火花 (Ca2 spark)的形式释放钙。这些钙在全细胞水平上总和即形成钙瞬变 (Ca2 transient)。因此 ,钙小星触发钙火花就构成了ECC中的基本事件。本文重点阐述LCCs和RyRs分子间的信号转导机制 ,也即从微观水平上探讨CICR及ECC的形成机制。     

骨质疏松中破骨细胞活性与其RyR表达的关系研究

目的:研究骨质疏松病理状态下破骨细胞活性的变化与其线粒体表面RyR表达之间的关系。方法:构建骨质疏松SD大鼠模型,2周后取长管骨骨髓血提取破骨细胞,筛选出发育成熟细胞核大于3的破骨细胞,高速离心法分离细胞胞质Cytosol和细胞内质网SR,Western-Blot分析骨质疏松状态下OC表达RyR通道蛋白的变化;进一步用FlaxStation 3分析OC细胞[Ca2+]i释放;最后评测骨质疏松环境下OC细胞活性和骨吸收能力变化。结果:与对照组相比,骨质疏松实验组大鼠OC细胞内质网SR上RyR蛋白表达显著减少;,同时破骨细胞[Ca2+]i释放减少导致OC细胞活性骨吸收能力显著增加。结论:破骨细胞内RyR通过调控其细胞内钙释放程度对OC活性产生影响。     

DMA增加正常大鼠心肌细胞钙瞬变和收缩

实验观察了钠氢交换或钠钙交换抑制剂 5 (N ,N 二甲基 )氨氯吡咪 (DMA)对正常和心肌肥厚大鼠分离心室肌细胞钙瞬变和细胞收缩的影响。通过负载荧光染料Fura 2 /Am ,应用离子影像分析系统 (IonImagingSystem)同步测定离体大鼠心肌细胞钙瞬变和细胞长度。结果表明 :DMA 10 μmol/L分别使钙瞬变和细胞缩短从对照组的 2 0 9.6 0± 5 4.96和 3.0 7± 0 .97μm增加到 2 38.5 0± 80 .41和 4.0 7± 1.0 2 μm (P <0 .0 5 ,n =7)。应用特异性反向钠钙交换阻断剂KB R7943可完全阻断DMA的激动作用。DMA还可使尼卡地平抑制L 型钙通道后的钙瞬变和细胞收缩增加。在肥厚心肌细胞 ,DMA表现出相同的药理作用 ,但对钙瞬变和细胞缩短的刺激作用更强。结果表明 :DMA可通过反向钠钙交换途径增加正常和肥厚大鼠心肌细胞钙瞬变和细胞收缩 ,且对肥厚心肌细胞的影响比对正常心肌细胞大。     

钙火花

“钙火花”是细胞钙信号转导的一个基本单位,由程和平、Cannell和Lederer于1993年在心肌细胞中首次发现并命名。当内质网“钙释放单位”（含50-300个簇状排列的钙释放通道分子）激活时,胞浆自由钙离子浓度局部瞬态增高,即产生钙火花。     

心衰心脏收缩蛋白分子变化及与收缩力的关系

采用ＤＯＣＡ硅胶管皮下埋入法建立大鼠心衰模型,从基因转录水平检测正常与心衰大鼠心肌组织中心肌收缩蛋白分子基因α－ＭＨＣ、β－ＭＨＣ、α－ｃａｒｄｉａｃａｃｔｉｎ、α－ｓｋｅｌｅｔａｌａｃｔｉｎ表达的变化。结果显示：（１）心衰大鼠心肌收缩力指标ｄｐ／ｄｔｍａｘ较正常大鼠明显降低（下降２７．５１％,Ｐ＜０．０１）,（２）心衰大鼠与正常大鼠相比,心肌组织中α－ＭＨＣ基因表达水平显著下降（降低２１．４３％,Ｐ＜０．０５）,β－ＭＨＣ基因表达水平显著升高（升高６２．４３％,Ｐ＜０．０１）、α－ｃａｒｄｉａｃａｃｔｉｎ基因和α－ｓｋｅｌｅｔａｌａｃｔｉｎ基因表达水平未见明显改变,（３）α－ＭＨＣｍＲＮＡ的含量与心肌收缩力指标ｄｐ／ｄｔｍａｘ值之间存在正相关关系（ｒ＝０．４１４３,ｎ＝４３,Ｐ＜０．０５）,β－ＭＨＣｍＲＮＡ的含量与ｄｐ／ｄｔｍａｘ值之间存在负相关关系。（ｒ＝－０．３９０２,ｎ＝４３,Ｐ＜０．０５）。这提示：心肌组织中ＭＨＣ基因表达水平的改变是心衰时心肌收缩力降低的主要分子基础