携带siSPK1重组腺病毒的构建及其对N2a细胞凋亡的影响

应用AdMax腺病毒载体系统构建携带siSPK1基因的重组腺病毒,进一步研究SPK1基因对N2a细胞凋亡的影响。设计可形成小发夹结构的SPK1-siRNA模板cDNA序列,克隆至质粒pDC316-siRNA,构建SPK1-siRNA穿梭质粒pDC316-SPK1,经鉴定正确后,将pDC316-SPK1与辅助包装质粒（pBHG loxΔE1,3 Cre）共转染至HEK293细胞,包装纯化并扩增重组腺病毒颗粒,终点稀释法测定病毒滴度;病毒感染N2a细胞,Western blot法检测SPK1蛋白的表达;Hoechst33258染色检测SPK1基因对N2a细胞凋亡的影响。酶切后PCR分析、测序鉴定表明,pDC316-SPK1构建成功,病毒纯化后滴度为2.50E＋10 PFU/mL;重组病毒可在蛋白水平抑制SPK1的表达;SPK1基因抑制后,N2a细胞凋亡增加（P〈0.001）。上述结果表明,含有SPK1-siRNA的重组腺病毒构建成功,且具有抑制SPK1蛋白表达的功能,该基因沉默后,N2a细胞凋亡增加。     

脂多糖诱导黑质多巴胺能神经元变性中小胶质细胞的反应

目的探讨小胶质细胞活化规律与脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导黑质多巴胺(DA)能神经元变性的关系。方法脑立体定位注射LPS入大鼠脑黑质后,采用特异性抗体0x．42标记不同时间点小胶质细胞的激活情况;酪氨酸羟化酶(tyrosine-hydroxylase,TH)免疫组织化学观察DA能神经元损害变化。结果小胶质细胞在LPS注入黑质6h后开始出现部分激活。12h大部分激活,为“灌木丛样”小胶质细胞;24h已完全激活,呈现“阿米巴样”,在随后的30d内,基本维持在此形态。而TH阳性细胞数在第3d开始出现下降,与对照组相比下降达45％,14d时下降至5～10％,至30d时几乎完全消失。结论小胶质细胞的激活先于DA能神经元变性,其激活介导的炎症反应在PD发病中具有重要的神经破坏作用。