一种基于新型再测序芯片的不明原因呼吸道感染样品检测方法的建立

再测序芯片(Resequencing Pathogen Microarray,RPM)是一种新的基于微阵列DNA芯片的病原体检测与鉴定技术。为了将RPM应用于不明原因呼吸道感染的检测,提高应对传染病暴发的能力,本研究建立了基于一种新型RPM的呼吸道多病原检测方法。该方法可以同时检测19种常见呼吸道病毒、9种甲型流感(Flu A)和11种鼻病毒(HRV)、28种肠病毒、18种少见呼吸道病毒。选取已验证的16种常见呼吸道病毒感染阳性的样本评价RPM的特异性,用克隆质粒或体外转录的RNA梯度稀释液来检验RPM的灵敏度,在10～103拷贝/反应水平时RPM仍能检测和分辨出相近的病毒亚型。将8份不明原因的咽拭子样品提取的核酸合并,用新建立的方法进行检测,根据RPM结果再以普通PCR加测序作为验证,同时和Abbott公司的质谱测序(PLEX-ID)结果进行比较,除RPM检出假阳性PIV1外,三者的其余检测结果一致。结果表明,这种基于新型RPM的方法具有高灵敏度、高通量的优点,对应对新发和突发传染病具有重要意义。     

含非竞争性内标四重荧光RT-PCR方法检测手足口肠道病毒方法的研究

旨在了解手足口病的流行和感染情况,并进行快速准确的检测。建立了含非竞争性内标的同时检测肠道病毒通用型、肠道病毒EV71型及柯萨奇病毒CA16型的四重荧光RT-PCR方法,对该方法的特异性、灵敏度等进行评价,并对多份临床样本进行应用检测。结果表明,该检测方法特异性强,对肠道病毒及其他人类非肠道病毒进行检测,显示了良好的特异性;该检测方法对EV71型和CA16型的检测灵敏度分别达到31.25 TCID50和1.25×102TCID50;将浓度为1×104TCID50及5×102TCID50的EV71样本进行重复性试验,其变异系数均小于1.5%;将浓度为5×102-5×105TCID50的EV71和CA16样本进行线性试验,其相关系数R2值在0.982-0.998之间。采用本研究建立的方法检测40份疑似临床样本,最后检出31份肠道病毒阳性样本,其中8例EV71型阳性,13例CA16阳性。另外,试验数据表明,内标对监控PCR抑制物的存在具有重要作用。本方法能同时快速检测所有肠道病毒并进行EV71型及CA16型的分型,并且灵敏度高、特异性好、扩增效率高,由于加入了内标,能有效地监控假阴性的出现,适合于手足口病的临床检测。     

同时鉴别6种鸡病毒性呼吸道病GeXP检测方法的建立

为了建立一种能够同时鉴别H5、H7、H9亚型禽流感、新城疫、传染性支气管炎和传染性喉气管炎6种鸡病毒性呼吸道传染病病原体的GeXP检测方法,本研究根据这些病原体各自的基因保守序列,设计合成了7对特异性引物,优化反应条件,用单一病毒、混合病毒样品来验证所建立的GeXP方法的特异性和准确性,以不同拷贝数的克隆质粒来检测GeXP方法的灵敏度。检测34份临床阳性样品,进一步验证该法的可靠性。结果显示,在7对引物同时存在的GeXP反应体系中,可特异性地扩增出相关6种病毒目的片段,并可在102拷贝/μL水平同时特异地检测出鸡6种病毒性呼吸道传染病,GeXP方法检测34份临床阳性样品结果与病毒分离一致。本研究建立的GeXP方法不仅可高通量检测6种病原体,而且具有特异性强和灵敏度高的特点,适用于临床样品混合感染的快速鉴别诊断,对这6种发病特征及临床症状相似的鸡病毒性呼吸道病的有效防控有很高的实际应用价值。     

木糖葡萄球菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及其应用

目的 本研究拟建立一种灵敏快速的实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR, qPCR)方法,用于检测大、小鼠木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus,S.xylosus)。方法 本研究选择特异性gehM基因片段作为靶标合成了一套引物,建立了木糖葡萄球菌检测的qPCR方法。对木糖葡萄球菌标准菌株和其他非目标菌进行特异性分析。将木糖葡萄球菌的DNA进行10倍稀释测定其灵敏度。用送检的样本进行了临床应用并测序验证,同时与培养法进行比较。结果 仅木糖葡萄球菌出现特异性扩增曲线,而其他非目标菌未出现,表明设计的引物对木糖葡萄球菌具有特异性,灵敏度为100 fg/μL,组内和组间重复性均小于3%。共检测60份临床样品,有5份样品扩增曲线为典型的S曲线,将该qPCR产物克隆测序并进行同源性比对,该序列与木糖葡萄球菌的同源性为99.63%,表明该样本木糖葡萄球菌核酸阳性,所检测样本阳性率为8.3%,而培养法的阳性率为6.7%,qPCR方法阳性检出率比培养法略高。结论 建立的木糖葡萄球菌qPCR方法,具有快速、灵敏度高、特异性强和重复性好的优点,可用于实...     

新型布尼亚病毒抗体检测方法的建立及初步应用简

目的：建立新型布尼亚病毒IgG抗体ELISA检测方法。方法：用基因工程重组表达的新型布尼亚病毒NP抗原包被酶联板,建立间接ELISA法检测新型布尼亚病毒IgG抗体,并进行特异性和灵敏度评价,健康人群中检测结果计算临界值（均值＋3标准差）。检测70例发热伴血小板减少综合征患者恢复血清和69份健康人血清样品。结果：在70份患者血清样品中,检测出新型布尼亚病毒IgG抗体阳性51例,阳性率为72．14％（51/70）;69份健康人血清样品中,检测出1份阳性,特异性为98．6％（1/69）。结论：建立的新型布尼亚病毒IgG抗体ELISA检测方法特异性强、灵敏度高,可用于新型布尼亚病毒感染的检测及流行病学调查。     

新型布尼亚病毒抗体检测方法的建立及初步应用

目的:建立新型布尼亚病毒IgG抗体ELISA检测方法。方法:用基因工程重组表达的新型布尼亚病毒NP抗原包被酶联板,建立间接ELISA法检测新型布尼亚病毒IgG抗体,并进行特异性和灵敏度评价,健康人群中检测结果计算临界值(均值+3标准差)。检测70例发热伴血小板减少综合征患者恢复血清和69份健康人血清样品。结果:在70份患者血清样品中,检测出新型布尼亚病毒IgG抗体阳性51例,阳性率为72.14%(51/70);69份健康人血清样品中,检测出1份阳性,特异性为98.6%(1/69)。结论:建立的新型布尼亚病毒IgG抗体ELISA检测方法特异性强、灵敏度高,可用于新型布尼亚病毒感染的检测及流行病学调查。     

结合内标的小鼠诺如病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

目的建立一种快速、特异、敏感的荧光定量RT-PCR检测方法,用于小鼠诺如病毒(murine norovirus,MNV)的检测。方法根据MNV ORF1-ORF2结合区域中保守序列设计一对特异性引物和Taqman探针,同时设计和制备了内标用于监控假阴性,建立含有内标的荧光定量RT-PCR检测体系,通过优化,得到最佳反应体系和反应条件;构建质粒标准品并以之为模板绘制标准曲线;进行特异性、敏感性和重复性试验,最后用建立的方法检测344份小鼠临床样本,验证在临床应用中的效果。结果该方法特异性强,与小鼠肝炎病毒、小鼠脑脊髓炎病毒、仙台病毒、小鼠肺炎病毒、呼肠孤病毒Ⅲ型、出血热病毒和淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒不发生交叉反应。构建的荧光定量标准曲线Ct值与模板浓度呈良好的线性关系相关系数r2=0.9986,可以检测到10 copies/μL的质粒标准品,对MNV活病毒检测可检测到1.78×10-2TCID50/m L的病毒,检测灵敏度比常规RT-PCR高10倍,比病毒分离高100倍。对5份样品进行5次批内和批间重复检测,检测结果变异系数均小于2%。通过对344份临床样品检测,检测到阳性样品103份,阳性率29.94%。有5份样本结果为假阴性。结论建立的MNV荧光定量RTPCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,由于加入了内标,能有效地监控假阴性的出现,适合用于MNV日常监测、临床诊断和流行病学调查。     

GeXP多重基因表达遗传分析系统在手足口病病原分型检测中的应用

利用GeXP多重基因表达遗传分析系统,建立一种多重逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法,同时检测引起手足口病的9种常见的人肠道病毒—人肠道病毒71型(HEV71)、柯萨奇病毒A组(CVA)16、4、5、9、10型和柯萨奇病毒B组(CVB)1、3、5型。优化多重反应体系中针对5’UTR区的肠道病毒通用引物和11对针对9种血清型人肠道病毒VP1区的特异性引物的浓度比例,分别以病毒细胞培养物和阳性粪便标本来验证多重反应体系的特异性,以TCID50定量的细胞培养物和克隆质粒体外转录的RNA梯度稀释液来检测多重检测体系的灵敏度。结果表明,优化后的多重检测体系,可扩增出人肠道病毒共有的保守片段的和型特异性片段,HEV71和CVA16细胞培养物的检测下限为100.5TCID50/μL,并可在103copies/μL水平同时、特异地检测出9种病毒RNA。该方法灵敏度高、特异性强,可快速对大量临床样本进行高通量检测,用于手足口病的分子流行病学调查。     

内标多重荧光RT-PCR同时检测肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型

【目的】为对当前爆发的手足口病进行快速准确的检测, 【方法】本研究建立了含内标的同时检测EV71和CA16的多重荧光RT-PCR方法,对该方法的特异性、灵敏度等进行评估,并对400多份临床样品进行了检测。【结果】实验结果表明,该检测方法特异性强,对10株EV71病毒、8株CA16病毒和25株其他人类病毒进行了检测,特异性为100%;该检测方法对EV71和CA16的检测灵敏度分别达到0.1 TCID50和1 TCID50;将0.1-104TCID50/ml EV71和CA16样本进行重复性实验,其变异系数分别为0.9-2.0%和0.9-2.3%。对400多份临床样品分别进行荧光RT-PCR检测和传统方法检测,结果显示,荧光RT-PCR对EV71和CA16的阳性检出率平均为46.1%和14.2%,比传统方法（34.5%和12.8%）的阳性检测率高。另外,实验数据显示,在粪便、直肠拭子、咽喉拭子样本中,PCR抑制物存在的比例为1.8%-3.4%,表明内标对监控PCR抑制物的存在具有重要作用。【结论】本方法能同时对EV71和CA16进行快速检测,并且灵敏度高,特异性好,由于加入了内标,能有效地监控假阴性的出现,适合于手足口病的临床检测。     

水貂肠炎病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立

根据Gen Bank登录的水貂肠炎病毒(MEV)VP2蛋白基因的保守序列设计了1对特异性引物,经PCR扩增出146bp的目的片段,并克隆到pMD 18-T载体上,提取重组质粒经PCR及测序鉴定正确后,以10倍梯度稀释质粒作为阳性标准品,绘制荧光定量标准曲线,以此建立一种基于SYBR Green荧光染料的定量PCR特异性检测水貂肠炎病毒的方法。结果表明:该方法对MEV有很好的特异性,检测灵敏度为34拷贝/μL,且重复性试验变异系数均小于2%。临床检测中,在80份样品中检测到30份阳性样品,高于普通PCR和电镜观察方法的检出率。该方法的建立实现了对MEV临床早期快速诊断和定量分析,为毛皮动物MEV的防控提供了可靠的检测方法。     

中东呼吸综合征冠状病毒多重荧光定量RT-PCR检测技术的建立

建立中东呼吸系统综合征冠状病毒(MERS-CoV)感染的筛查与诊断应用的核酸检测方法。本研究建立了基于MERS-CoV三个分子靶标(upE,ORF1b,N2)的双重以及三重的三种荧光定量RT-PCR检测技术方法,分别与前期建立的单重荧光定量RT-PCR(upE或N2)检测方法做了比较,并且采用MERS-CoV病毒毒株、上海提供的口岸发烧病人样本以及由首例中国MERS-CoV韩国地区输入病例的咽拭子样品和全血的样品做了临床验证。结果显示:采用MERS-CoV病毒毒株作为模板,三种新建立的多重检测方法与单重荧光定量RT-PCR检测方法最低检测限均能达到10PFU/mL,且与其他常见呼吸道病毒的阳性样本均无交叉反应,特异性良好。对临床样品的验证中,上海病人咽拭子样本均为阴性,而中国首例MERS输入病例的急性期咽拭子样品均为阳性,而全血样的检测结果显示N2靶标有较高检出率,明显优于基于upE单一靶标。本研究所建立的基于MERS-CoV三个分子靶标(upE,ORF1b,N2)的双重以及三重荧光定量RT-PCR检测技术方法用于MERS-CoV感染的实验室诊断,具有较高灵敏度与特异性及适用性。     

PDCoV、SADS-CoV与SVA三重RT-PCR检测方法的建立与应用

【背景】猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)、新型猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)与塞内卡病毒A型(Seneca virus A,SVA)均为猪的新发病原,严重危害养猪业的发展。猪感染这3种新发病原难以根据临床症状诊断,因此亟须建立多重RT-PCR检测方法对疑似患病猪进行快速诊断,以降低经济损失。【目的】建立能同时检测PDCoV、SADS-CoV和SVA单一或混合感染的三重RT-PCR检测方法。【方法】参考GenBank中登录的PDCoV和SADS-CoV N基因、SVA L/P1基因保守区域,设计3对特异性引物,以温度梯度PCR法确定最适退火温度(T_m);采用方阵法优化其引物浓度;构建重组质粒PMD-PDCoV、PMD-SADS-CoV和PMD-SVA作为标准品确定最小检测量(limits of detection,LOD);以猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等6种常见感染猪的病毒核酸样本为模板,确定三重RT-PCR法的特异性;以批间和批内实验验证其重复性;经检测疑似感染的临床样本并与已报道的检测方法进行比较,评估其临床应用效果。【结果】最佳退火温度为58.3℃;引物最佳浓度分别为0.5、0.25和0.25μmol/L;其敏感性高,PMD-PDCoV、PMD-SADS-CoV与PMD-SVA最低检测限分别为1、1和10copies/μL;其特异性强,仅对PDCoV、SADS-CoV和SVA有特异性条带,对其他病毒均无扩增条带;该方法重复性好,批间和批内实验检测结果均一致。经临床样本检测PDCoV、SADS-CoV和SVA的阳性率分别为65.85%、30.49%和57.32%,与已报道的检测方法一致。最后从13份PDCoV、SADS-CoV和SVA均为阳性的样品中随机选取5份样品进行测序,并做同源性及进化树分析,结果显示5份阳性病料的PCR扩增序列之间相似性较高,而且和参考序列之间也具有较高的相似性,均可达到96%以上。表明本研究建立的方法在应用于临床样品检测中具有较高的准确性和可靠性。【结论】建立了一种能够同时快速检测PDCoV、SADS-CoV和SVA的三重RT-PCR方法,为临床上检测上述3种病毒提供了技术支撑。     

中东呼吸综合征冠状病毒RT-RAA快速检测方法的建立及应用

建立基于重组酶介导的中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)核酸检测方法。本研究设计、合成特异性中东呼吸综合征冠状病毒基因的重组酶介导检测(RAA)引物及探针,制备MERS-CoV假病毒颗粒阳性对照品,通过一系列条件优化建立了MERS-CoV的快速、灵敏、特异的RT-RAA检测方法,分别与荧光定量RT-PCR检测方法做比较,并且采用首例中国MERS-CoV韩国地区输入病例的咽拭子样品、其它类似呼吸道病毒样本以及英国QCMD的MERS-CoV室间质评灭活样本做临床验证。结果显示:建立的RT-RAA方法检测中东呼吸综合征冠状病毒灵敏度为10拷贝,高于本实验室建立的荧光RT-PCR方法灵敏度(100拷贝),且检测时间(4.8～13.6min)大大低于荧光RT-PCR检测时间(90min);用该方法检测中东呼吸综合征冠状假病毒颗粒为阳性,而检测其他8种对照呼吸道病毒均呈阴性;检测临床阳性样本也与实际结果相符。本研究建立的中东呼吸综合征冠状病毒RT-RAA检测方法灵敏、特异、快速,可用于中东呼吸综合征冠状病毒感染的现场快速诊断和流行病学调查。     

高通量流式荧光微球悬液芯片检测乙肝病毒基因分型

目的:建立HBV基因分型高通量液相芯片检测技术,并探讨其应用价值.方法:对GenBank中收录的明确分型的HBV基因序列进行分析,选择preS2-S区设计引物和A、B、C和D型特异性探针.与荧光编码微球偶联的特异型探针与一条引物生物素标记的PCR产物直接杂交反应,然后结合亲和素标记的藻红蛋白,用流式检测仪(Bio-Plex 200)检测荧光信号.检测182份阳性乙肝患者血清DNA,其中35份样品检测结果与测序法比较.用B、C型质粒DNA倍比稀释及混合样品检测灵敏度来评估该方法.结果:建立了HBV基因分型的快速高通量液相芯片检测方法.182份患者血清检测结果为:B型占24.2％ (44/182),C型占71.4％(130/182),D型为6.6 ％(12/182),BC混合型4.4％(8/182).其中35份样本与测序法比较,除3份混合型测序法未检出外,其它32例结果均相同本方法的灵敏度检测下线为1×103 copies/mL.结论:应用悬液芯片技术进行乙肝病毒的基因分型分析,具有较好的特异性和较高的灵敏度,并有简便、灵活和高通量等优势.该检测系统不仅在科研中有广泛的前景,也有望成为临床推广的多重分子诊断和基因分型的新方法.     

基于 LUX 引物的 HBV 实时 PCR检测方法的建立

实时PCR技术因其快速、准确、灵敏度和重复性高、可减少交叉污染等特点而广泛应用于分子生物学和医学研究领域。本研究建立了一种基于LUX （Light Upon eXtension）引物的HBV病毒载量检测的实时定量PCR检测方法。通过检测系列稀释的HBV DNA（5-5×108拷贝/反应）来验证LUX实时分析的性能和灵敏度。结果表明该检测方法在Ct值和log10 HBV DNA浓度之间存在很好的线形关系,并且具有很高的灵敏度,检测低限可达每毫升血清中50拷贝的HBV。对91份阳性血清样品的检测和熔解曲线分析表明该方法具有很高的特异性。新建立的LUX实时检测方法为检测治疗效果、研究HBV病毒载量和疾病发展之间的关系提供了一种理想的工具。     

猪丁型冠状病毒荧光定量RT-PCR与S1蛋白间接ELISA检测方法的建立及应用

最近,新发现的猪丁型冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCo V)可导致仔猪腹泻,亟待建立有效准确的核酸及血清学检测方法并调查猪场的PDCo V感染情况。本研究采用针对病毒M基因的探针荧光定量RT-PCR检测方法,对2014-2015年间收集的河南、湖南、浙江、江西、安徽、河北、黑龙江、江苏、山东和上海等10个省市收集的共254份腹泻仔猪小肠匀浆或粪便样本进行检测,共检出11份PDCo V阳性样本,总阳性率为4.33%。采用在昆虫细胞表达纯化的PDCo V囊膜S1蛋白为包被抗原,建立间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,检测2015-2016年间收集的来自江苏、湖南、浙江等7个省份的609份具有腹泻症状的猪血清样品,抗PDCo V S1抗体检出率为44.17%(269/609)。上述建立的两种方法分别针对病毒的RNA或抗体对PDCo V进行特异性检测,可以应用于PDCo V流行情况的监控。     

Nipah病毒一步法Real-time RT-PCR检测方法的建立

目的建立针对Nipah病毒N基因的一步法Real-time RT-PCR检测方法,用于Nipah病毒感染样本的快速准确检测和定量。方法针对Nipah病毒的保守基因N设计引物和探针,建立一步法Real-time RT-PCR反应方法并分析敏感性和特异性。结果所设计的引物经Blast检索可以用于检测所有已知的Nipah病毒株。本研究建立的一步法Real-time RT-PCR方法可以特异性检测出Nipah病毒,不与Hendra病毒产生交叉反应。检测灵敏度为1.1×100～1.1×101copies/μl。标准曲线的线性范围为1.1×102～1.1×106copies/μl。结论本研究建立的一步法real-time RT-PCR方法敏感性和特异性较高,且不易出现污染引起的假阳性结果,适合用于Nipah病毒感染样本的检测。     

Hendra病毒一步法Real-time RT-PCR检测方法的建立

目的 建立针对Hendra病毒N基因的一步法Real-time RT-PCR检测方法,用于Hendra病毒感染样本的快速检测和准确定量.方法 针对Hendra病毒的保守基因N设计引物和探针,构建体外转录的RNA片段作为标准品,建立一步法Real-time RT-PCR反应方法并分析敏感性和特异性.结果 所设计的引物经Blast检索可以用于检测所有已知的Hendra病毒株.本研究建立的一步法Real-time RT-PCR方法可以特异性检测出Hendra病毒,不与Nipah病毒产生交叉反应.检测灵敏度为2.6×100～2.6×101copies/μl.标准曲线的线性范围为2.6×101～2.6×107copies/μl.结论 本研究建立的一步法Real-time RT-PCR方法敏感性和特异性较高,且不易出现污染引起的假阳性结果,适合用于Hendra病毒感染样本的检测.     

基于基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱的猪呼吸道病毒多目标鉴定方法的建立和应用北大核心

【目的】建立能高效同步鉴定猪伪狂犬病毒(porcine pseudorabies virus,PRV)、猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV-2)和3型(porcine circovirus 3,PCV-3)、非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)以及猪博卡病毒1型(porcine bocavirus group 1,PBoV-G1)、2型(porcine bocavirus group 2,PBoV-G2)和3型(porcine bocavirus group 3,PBoV-G3)等呼吸道病毒的核酸基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)高通量多目标检测技术。【方法】根据7种病原体基因的保守序列,分别设计不同病原的引物及对应的单碱基延伸探针,通过引物浓度和反应条件优化,方法特异性、敏感性和稳定性分析,以及临床样本和猪源产制品的检测验证,建立常见猪呼吸道DNA病毒的MALDI-TOF MS多目标检测体系。【结果】质谱分析显示,多目标检测体系的7种靶标产物峰只在特定病毒阳性样品检测时产生,与其他病原体检测无交叉反应,表明该方法对7种靶标病毒检测特异性良好。重复性试验结果分析显示,体系中每种病毒在高、中、低浓度时批内阳性符合率均≥98.0%,批间均≥98.3%,表明该方法具有较高的稳定性。体系中7种病原体每种病毒最低检测限在8.65–26.27拷贝/μL之间,与荧光PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)检测方法相当。采用MALDI-TOF MS多重检测方法对100份组织、饲料和猪肉样品进行检测应用,检出2种及以上混合感染样品39份,其中5份样本同步检出5种病原体阳性;对8份ASFV-p72假病毒人工污染样品进行验证,均可检出ASFV阳性。将以上样本检测应用结果与荧光PCR方法进行比对验证,2种方法对于不同病原体检测结果的符合率高达94.4%–100%。【结论】本研究建立的基于MALDI-TOF MS的猪呼吸道常见DNA病毒多重检测方法为猪群相关疫病快速监测和鉴别诊断,以及便利化进出口动物检疫等提供了一种新的敏感、特异的高通量多目标检测技术。