含非竞争性内标四重荧光RT-PCR方法检测手足口肠道病毒方法的研究

旨在了解手足口病的流行和感染情况,并进行快速准确的检测。建立了含非竞争性内标的同时检测肠道病毒通用型、肠道病毒EV71型及柯萨奇病毒CA16型的四重荧光RT-PCR方法,对该方法的特异性、灵敏度等进行评价,并对多份临床样本进行应用检测。结果表明,该检测方法特异性强,对肠道病毒及其他人类非肠道病毒进行检测,显示了良好的特异性;该检测方法对EV71型和CA16型的检测灵敏度分别达到31.25 TCID50和1.25×102TCID50;将浓度为1×104TCID50及5×102TCID50的EV71样本进行重复性试验,其变异系数均小于1.5%;将浓度为5×102-5×105TCID50的EV71和CA16样本进行线性试验,其相关系数R2值在0.982-0.998之间。采用本研究建立的方法检测40份疑似临床样本,最后检出31份肠道病毒阳性样本,其中8例EV71型阳性,13例CA16阳性。另外,试验数据表明,内标对监控PCR抑制物的存在具有重要作用。本方法能同时快速检测所有肠道病毒并进行EV71型及CA16型的分型,并且灵敏度高、特异性好、扩增效率高,由于加入了内标,能有效地监控假阴性的出现,适合于手足口病的临床检测。     

肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型多重反转录聚合酶链反应的建立及初步应用

本文旨在建立一种快速、高效的方法检测肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A16型(CA16)的方法,以用于儿童手足口病的病原学监测。通过设计肠道病毒通用引物和CA16与EV71的型特异性引物,建立不同引物浓度配比及两阶段退火温度以提高检测敏感性和特异性的多重反转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法,并对首都儿科研究所附属儿童医院2010年3~10月收集的371例手足口病患儿共381份临床标本同时进行病毒分离和核酸检测。结果显示,本研究建立的多重RT-PCR方法对CA16和EV71的最低模板检测浓度分别为5.32 pg/ml和0.64 pg/ml,反应特异度为100%。应用该方法检测381份手足口病临床标本的总阳性率为78.4%,其中CA16与EV71的检测阳性率分别为32.6%和35.8%,二者检测阳性比为1:1.1。以病毒分离为标准,多重RT-PCR对CA16及EV71检测的准确率分别为95.2%和98.6%。因此,本研究新建立的多重RT-PCR方法准确、简便,适用于较大量样本的手足口病病原学监测。2010年引起北京地区儿童手足口病的主要病原为CA16和EV71。     

新乡地区2011年肠道病毒71型VP1基因特征分析及手足口病流行特点

为了解新乡地区2011年肠道病毒71型(EV71)VP1基因特征及手足口病流行特点,采用荧光RT-PCR对临床诊断的粪便标本进行总肠道病毒(EV)、柯萨奇病毒A16(CA16)和EV71检测;选取10例EV71阳性标本进行VPl序列扩增并测序,所得序列进行同源性分析和构建系统发生树;对2011年新乡市手足口病疫情监测数据进行分析。结果显示,重症标本的EV71阳性率(73%)显著高于CA16阳性率(19%)(P<0.01);10株新乡EV71分离株的核苷酸及氨基酸差异分别为2.8%和0.9%,属于C4亚型的C4a簇;9株VP1区第170位氨基酸为A,1株为V;与近缘的C4a型代表株相比,新乡优势株的氨基酸变异一般发生在VP1第292位氨基酸(T→A);2011年新乡市共上报手足口临床诊断病例1118例,92%的发病年龄在3岁以下,发病高峰分别出现在4和12月份,提示一定要加强手足口病预防控制,寒冷天气尤其不能忽视。     

埃可病毒9型荧光RT-PCR快速检测方法的建立及应用

为了建立特异、灵敏、快速的荧光定量RT-PCR方法用于检测埃可病毒9型病毒核酸,并初步应用于埃可病毒9型的临床标本检测。根据GenBank登录的埃可病毒9型毒株VP1基因序列,应用生物学软件进行序列比对,在保守区设计特异性引物和TaqMan探针。对反应条件进行优化,验证方法的特异性、灵敏度和重复性,同时对疑似埃可病毒9型病例标本进行检测。该方法对埃可病毒9型的检出有高度特异性,与EV71、CA16、CA24v、CA6、CA10、埃可病毒30型等均无交叉反应,检测灵敏度均达0.1TCID50/mL,可从疑似埃可病例粪便标本中直接检测病毒核酸,检测仅需3~4h。本研究建立的埃可病毒9型TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法特异、灵敏,适用于临床早期诊断。     

2007年北京地区儿童手足口病病原的初步筛查

2007年4～6月儿童手足口病流行期间,对北京地区51例皮损症状典型、伴/不伴发热、无重症合并症的手足口病患儿采样,建立RT-PCR方法,以5'非编码区(5'UTR)肠道病毒通用引物、CA16和EV71 VP1区特异性引物直接对82份临床标本进行了初步筛查,肠道病毒阳性率达70.6%。检测病例中CA16阳性25例(25/51)、EV71阳性4例(4/51)、非CA16和EV71的肠道病毒阳性病例7例(7/51),三者比例约为6:1:2。2007年北京地区儿童轻症手足口病主要病原包括CA16和EV71,同时还存在一定比例其它肠道病毒。部分EV71毒株经测序验证及系统进化分析显示为C4基因亚型。     

肠道病毒71型北京分离株VP4基因序列及蛋白抗原性分析

为探讨肠道病毒71型(EV71)VP4基因序列与手足口病(HFMD)不同临床类型之间的关系,分析重组蛋白EV71 VP4的抗原性,并初步探讨其与柯萨奇病毒A16(CA16)重组蛋白VP4是否存在交叉反应性,对2007~2009年从北京患HFMD儿童标本分离到的10株EV71的VP4基因进行克隆测序,运用生物学软件对测序结果进行比较分析,并选择其中1株与1株同期分离的CA16的VP4分别进行原核表达;用表达产物对189份正常体检的成人及来首都儿科研究所就医的非HFMD患儿血清中的IgG进行Western Blot检测,并分析14份确诊为EV71感染和12份CA16感染患者急性期血清中的IgM抗体。分析表明这10株EV71 VP4基因核苷酸同源性为94.20%~100.00%,所推导的氨基酸序列则完全相同,从重症与轻症患儿分离的毒株之间VP4的核苷酸序列未见一致性的差异,基于EV71 VP4基因核苷酸序列的进化树分析表明2007~2009年北京地区所流行的毒株均属于C4亚型;本研究中EV71和CA16的VP4核苷酸序列的同源性为69.60%,所推导的氨基酸序列的同源性为78.60%,在运用Western Blot检测189份血清中的VP4特异性IgG时,EV71 VP4的血清阳性率为38.10%,说明其具有良好的抗原性,CA16 VP4的血清阳性率为58.20%,两者差别具有显著统计学意义(2χ=15.30,P<0.01),提示EV71 VP4与CA16 VP4没有交叉反应性;在用表达的VP4检测已确诊为相应病毒的特异性IgM时,两者皆为阴性,提示感染后机体对VP1和VP4产生不同的反应。     

湘潭地区2013-2014年手足口病病原监测结果分析

目的:分析2013-2014年湖南省湘潭市手足口病(HFMD)病原体型别及分布特征,为进一步完善HFMD的预防和治疗提供依据。方法:采用RT-PCR方法,对571例HFMD患儿进行肠道病毒通用型核酸(EV-RNA)、EV71及柯萨奇病毒A16(CA16)检测。结果:2013年除EV71及CA16外其他EV核酸阳性率75.30%,明显高于EV71的17.65%和CA16的7.05%(P0.05),2014年EV71型核酸阳性率为50.68%,明显高于CA16的19.93%和其他EV的29.39%(P0.05)。重症HFMD患儿EV71感染率明显高于轻症。结论:2013年湘潭地区HFMD患儿以除EV71及CA16外的其他EV病毒感染为主,2014年湘潭地区HFMD患儿以EV71感染为主。     

2009年上海市手足口病流行病学和病原学特征

本研究对上海市手足口病(Hand-foot-and-mouth disease,HFMD)的流行病学和病原学特征进行了分析。从国家疾病监测信息报告管理系统获取上海市2009年HFMD的流行病学数据;采用荧光定量RT-PCR方法对来自上海15个区县的799例HFMD进行肠道病毒(Enterovirus,EV)核酸检测;对部分肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)的VP1区和部分其它EV的VP4区序列进行测定和分析。采用Office excel软件进行简单数据统计分析,用BioEdit和MEGA软件进行病毒基因特征分析,通过BLAST服务器的在线比对进行EV型别鉴定。分析显示:上海市18个区县均有病例报告,地区分布无显著特点;小于6岁的婴幼儿期为疾病高发年龄段;4～7月为发病高峰期;EV71和柯萨奇病毒A16(Coxsackie virus A16,CA16)为主要病原,不同地区、不同月份的病原构成各不相同,CA16为轻症病例的主要病原,EV71则为重症病例的主要病原;基于VP1区序列分析,上海EV71毒株与C4a亚型毒株具有最近的亲缘性和最高的同源性;2株其它肠道病毒经鉴定属于CA2和CA10型。结果表明:EV71和CA16为2009年上海HFMD流行的主要病原,EV71属于C4a亚型;除EV71和CA16外,还存在小部分其它EV(如:CA2和CA10)引起的HFMD。     

115例手足口病原学监测结果分析

目的:探讨长沙地区手足口病的病原学特征,为当地的疾病预防和控制提供科学依据.方法:使用肠道通用和EV71、CA16特异性引物,对2009年长沙市的115例手足口病患者的疱疹液、粪便、咽拭子标本,进行RT-PCR鉴定,并对手足口病疫情开展监测,采用流行病学方法对结果进行统计分析.结果:在采集到标本的115例患者中,84例患者检测结果为阳性,其中19例检测为EV71病毒核酸阳性(22.62%);30例检测CA16阳性(35.71%);35例检测到其他肠道病毒(41.67%).阳性标本中男女性别比为(1.27:1),发病年龄主要集中1-5岁儿童(90.47%),尤其是在3岁组(34.52%);发病季节主要集中于4-8月.结论:在长沙地区手足口病易发于1-5岁儿童,应在春夏季重点加强这一人群的预防和控制措施.     

肠道病毒71型的RT-PCR诊断及基因特征

2002～2003年从上海市和重庆市手足口病患儿的疱液标本中分离到10株病毒,其中上海9株,重庆1株.利用两对分别针对EV71和Cox.A16病毒VP1区的特异性引物,用RT-PCR方法对病毒进行初步鉴别.根据PCR所用引物及PCR扩增出的产物片段大小不同,可初步判定出EV71和Cox.A16病毒的血清型别.RT-PCR结果提示,上海分离到的9株病毒中,有2株为EV71,其余7株病毒为Cox.A16;重庆分离到的1株病毒为EV71.10株病毒的RT-PCR产物经序列测定和分析证实,PCR定型结果正确,说明PCR法具有很高的特异性,可作为EV71初步鉴定的首选方法.对所分离的3株EV71病毒进行VP1区编码基因全序列的测定和遗传学分析,通过同源性比较和构建系统发生树发现,此3株EV71病毒和中国大陆已发表的7株EV71病毒(SHZH03、SHZH98、SH-F1、SH-F2、SH-H25、SH-H26和CHN-87)全部属于C基因型,与该型代表株比较,同源性为89.3%～94.6%;与A、B基因型代表株比较,同源性为81.3%～84.0%,差异较大.在C基因型中,此3株EV71病毒和中国大陆先前分离的6株病毒(SHZH03、SHZH98、SH-F1、SH-F2、SH-H25、SH-H26)的同源性较高,在94.5%～100%范围内.在系统发生树上,这9株病毒形成一个较独立的分支.与CHN-87株的同源性在92.1%～93.6%之间.与已知的C1、C2、C3亚型代表株比较,同源性在89.3%～92.9%,差异≥7%,因此认为可将这9株病毒划分为C4亚型.上海、重庆和深圳的EV71病毒有较高的同源性,提示该病毒EV71-CA亚型在中国大陆1998～2003年间有较广泛的传播.建立中国流行的EV71病毒毒株库和基因库,对诊断、预防和控制EV71在中国的爆发有重要意义,对加强EV71的实验室诊断、病毒学监测和病毒基因型和亚型的标准命名和分子流行病学研究有重要帮助.     

A One-Step,Triplex, Real-Time RT-PCR Assay for the Simultaneous Detection of Enterovirus 71, Coxsackie A16 and Pan-Enterovirus in a Single Tube

The recent, ongoing epidemic of hand, foot, and mouth disease (HFMD), which is caused by enterovirus infection, has affected millions of children and resulted in thousands of deaths in China. Enterovirus 71 (EV71) and coxsackie A16 (CA16) are the two major distinct pathogens for HFMD. However, EV71 is more commonly associated with neurologic complications and even fatalities. Therefore, simultaneously detecting and differentiating EV71 and CA16 specifically from other enteroviruses for diagnosing HFMD is important. Here, we developed a one-step, triplex, real-time RT-PCR assay for the simultaneous detection of EV71, CA16, and pan-enterovirus (EVs) in a single tube with an internal amplification control. The detection results for the serially diluted viruses indicate that the lower limit of detection for this assay is 0.001–0.04 TCID₅₀/ml, 0.02 TCID₅₀/ml, and 0.001 TCID₅₀/ml for EVs, EV71, and CA16, respectively. After evaluating known HFMD virus stocks of 17 strains of 16 different serotypes, this assay showed a favorable detection spectrum and no obvious cross-reactivity. The results for 141 clinical throat swabs from HFMD-suspected patients demonstrated sensitivities of 98.4%, 98.7%, and 100% for EVs, EV71, and CA16, respectively, and 100% specificity for each virus. The application of this one-step, triplex, real-time RT-PCR assay in clinical units will contribute to HFMD surveillance and help to identify causative pathogen in patients with suspected HFMD.     

GeXP多重基因表达遗传分析系统在手足口病病原分型检测中的应用

利用GeXP多重基因表达遗传分析系统,建立一种多重逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法,同时检测引起手足口病的9种常见的人肠道病毒—人肠道病毒71型(HEV71)、柯萨奇病毒A组(CVA)16、4、5、9、10型和柯萨奇病毒B组(CVB)1、3、5型。优化多重反应体系中针对5’UTR区的肠道病毒通用引物和11对针对9种血清型人肠道病毒VP1区的特异性引物的浓度比例,分别以病毒细胞培养物和阳性粪便标本来验证多重反应体系的特异性,以TCID50定量的细胞培养物和克隆质粒体外转录的RNA梯度稀释液来检测多重检测体系的灵敏度。结果表明,优化后的多重检测体系,可扩增出人肠道病毒共有的保守片段的和型特异性片段,HEV71和CVA16细胞培养物的检测下限为100.5TCID50/μL,并可在103copies/μL水平同时、特异地检测出9种病毒RNA。该方法灵敏度高、特异性强,可快速对大量临床样本进行高通量检测,用于手足口病的分子流行病学调查。     

Development and Evaluation of a Pseudovirus-Luciferase Assay for Rapid and Quantitative Detection of Neutralizing Antibodies against Enterovirus 71

The level of neutralizing antibodies (NtAb) induced by vaccine inoculation is an important endpoint to evaluate the efficacy of EV71 vaccine. In order to evaluate the efficacy of EV71 vaccine, here, we reported the development of a novel pseudovirus system expression firefly luciferase (PVLA) for the quantitative measurement of NtAb. We first evaluated and validated the sensitivity and specificity of the PVLA method. A total of 326 serum samples from an epidemiological survey and 144 serum specimens from 3 clinical trials of EV71 vaccines were used, and the level of each specimen''s neutralizing antibodies (NtAb) was measured in parallel using both the conventional CPE-based and PVLA-based assay. Against the standard neutralization assay based on the inhibition of the cytopathic effect (CPE), the sensitivity and specificity of the PVLA method are 98% and 96%, respectively. Then, we tested the potential interference of NtAb against hepatitis A virus, Polio-I, Polio-II, and Polio-III standard antisera (WHO) and goat anti-G10/CA16 serum, the PVLA based assay showed no cross-reactivity with NtAb against other specific sera. Importantly, unlike CPE based method, no live replication-competent EV71 is used during the measurement. Taken together, PVLA is a rapid and specific assay with higher sensitivity and accuracy. It could serve as a valuable tool in assessing the efficacy of EV71 vaccines in clinical trials and disease surveillance in epidemiology studies.     

三重PCR检测鱼类致病性嗜水气单胞菌

[目的]建立一种能够快速准确地检测致病性嗜水气单胞菌的PCR.方法.[方法]根据嗜水气单胞菌的16S rRNA、气溶素基因(aer)和丝氨酸蛋白酶基因(ahp)的保守序列设计了3对引物,然后进行了PCR反应条件的优化、特异性和敏感性的检测并与普通的细菌分离鉴定进行了临床样本和人工攻毒样本检出率的比较.[结果]该方法特异性好,只对致病性嗜水气单胞菌呈阳性扩增;敏感性高,最低可检测100fg的细菌DNA模版.对临床疑似黄鳝(Monopterus albus)样本的检出率为81.8%,高于细菌分离的40.9%;对人工攻毒鲫鱼(Carassius auratus)样本的检出率为87.5%,高于细菌分离的67.5%.[结论]本方法的成功建立,实现在同一反应管中同时对16SrRNA、aer和ahp的检测,避免了只针对aer或ahp单个毒力基因的PCR检测方法可能存在的漏检和误检,为致病性嗜水气单胞菌的诊断、大规模检疫、流行病学调查等提供了一种快速、准确而有效的检测方法.     

Evaluation of a Viral Microarray Based on Simultaneous Extraction and Amplification of Viral Nucleotide Acid for Detecting Human Herpesviruses and Enteroviruses

In this study, a viral microarray based assay was developed to detect the human herpesviruses and enteroviruses associated with central nervous system infections, including herpes simplex virus type 1, type 2 (HSV1 and HSV2), Epstein-Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV), enterovirus 71 (EV71), coxsackievirus A 16 (CA16) and B 5(CB5). The DNA polymerase gene of human herpesviruses and 5’-untranslated region of enteroviruses were selected as the targets to design primers and probes. Human herpesviruses DNA and enteroviruses RNA were extracted simultaneously by using a guanidinium thiocyanate acid buffer, and were subsequently amplified through a biotinylated asymmetry multiplex RT-PCR with the specific primer of enteroviruses. In total, 90 blood samples and 49 cerebrospinal fluids samples with suspected systemic or neurological virus infections were investigated. Out of 139 samples, 66 were identified as positive. The specificities of this multiplex RT-PCR microarray assay were over 96% but the sensitivities were various from 100% for HSV1, HSV2, EV71 and CB5, 95.83% for CMV, 80% for EBV to 71.43% for CA16 in comparison with reference standards of TaqMan qPCR/qRT-PCR. The high Kappa values (&gt;0.90) from HSV1, HSV2, CMV, EV71 and CB5 were obtained, indicating almost perfect agreement in term of the 5 viruses detection. But lower Kappa values for EBV (0.63) and CA16 (0.74) displayed a moderate to substantial agreement. This study provides an innovation of simultaneous extraction, amplification, hybridization and detection of DNA viruses and RNA viruses with simplicity and specificity, and demonstrates a potential clinical utility for a variety of viruses’ detection.     

肠道病毒EV71 IgM抗体参考品的建立

目的建立肠道病毒EV71 IgM抗体检测用参考血清盘。方法通过收集手足口病感染早期患者的咽拭子和血清,对咽拭子病毒进行分离、鉴定、基因分型,通过血清中和试验及酶联免疫吸附试验(捕获法)的验证,确定EV71 IgM抗体阳性样品,组建EV71 IgM抗体参考血清盘,并经3家实验室对该参考血清盘进行协同标定和确认。结果 12名患儿的咽拭子中均分离到EV71病毒,在RD细胞上引起细胞病变。通过套式PCR扩增、序列测定后进化树分析确认均为流行的C4基因亚型。每名患儿的双份血清均可中和EV71病毒,抗体效价为1∶512~1∶2048。通过捕获法进行EV71 IgM抗体检测结果均为阳性。以此12份样品为原料制备EV71 IgM抗体阳性参考品,同时以12份EV71 IgM抗体阴性血清制备阴性参考品,建立了由12份阳性参考品、12份阴性参考品、1份最低检出限参考品和1份精密性参考品组成的肠道病毒EV71 IgM抗体参考血清盘。通过3家实验室协同标定,各实验室间差异均无统计学意义。结论建立了EV71 IgM抗体检测参考血清盘,为相关检测试剂的质量控制和评价提供了参考标准。