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1.
根据GenBank上所公布的新城疫病毒(NDV)的全基因组序列,设计了8对引物,运用RT-PCR方法获取了3株广西地方强毒株GX7/02、GX9/03和GX11/03的全基因组序列,并对其进行了比较分析。此3株病毒的全基因组序列均由15192个碱基组成,与GenBank公布的ZJ1、U.S/Largo/71、Italy/2736/00等7个毒株的全基因组序列长度相同,比LaSota、Clone-30和B1的全基因组序列多出6个核苷酸,此6个核苷酸位于np基因的非编码区内,相对与NDV毒株LaSota、Clone-30和B1序列的1647~1648nt位。通过序列的比较分析,发现GX7/02、GX9/03和GX11/03与ZJ1毒株的同源性较高,而与LaSota、Clone-30和B1等毒株的同源性较低。  相似文献   
2.
三株新城疫广西分离株全基因组序列的测定与分析   总被引:1,自引:0,他引:1  
根据GenBank上所公布的新城疫病毒(NDV)的全基因组序列,设计了8对引物,运用RT-PCR 方法获取了3株广西地方强毒株GX7/02、GX9/03和GX11/03的全基因组序列,并对其进行了比较分析.此3株病毒的全基因组序列均由15192个碱基组成,与GenBank公布的ZJ1、U.S/Largo/71、Italy/2736/00等7个毒株的全基因组序列长度相同,比LaSota、Clone-30和B1的全基因组序列多出6个核苷酸,此6个核苷酸位于np基因的非编码区内,相对与NDV毒株LaSota、Clone-30和B1序列的1647~1648nt 位.通过序列的比较分析,发现GX7/02、GX9/03和GX11/03与ZJ1毒株的同源性较高,而与LaSota、Clone-30和B1等毒株的同源性较低.  相似文献   
3.
环介导等温可视扩增检测牛分枝杆菌方法的建立   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的:建立一种快速简便检测牛分枝杆菌的方法。方法:根据已发表的牛分枝杆菌特殊基因序列,设计并合成6对特异扩增牛分枝杆菌特异性基因片段的引物,通过条件优化,建立针对牛分枝杆菌的环介导等温扩增(LAMP)检测法,测定其特异性和敏感性,并对采集的牛临床样品的DNA分别进行检测。结果:采用该法只检出牛分枝杆菌,检测的最低拷贝数为1×102拷贝/μL。结论:建立的LAMP方法简便、快速、特异性高,可用于临床上牛分枝杆菌的快速检测。  相似文献   
4.
WSSV和IHHNV二重实时荧光PCR检测方法的建立   总被引:6,自引:2,他引:4  
根据基因库中对虾白斑综合征病毒WSSV(AF369029)和传染性皮下及造血器官坏死病毒IHHNV(AF218226)基因序列,设计了WSSV和IHHNV的两对特异性引物和两条用不同荧光基团标记的TaqMan探针。对反应条件和试剂浓度进行优化,建立了能够同时检测WSSV和IHHNV的二重实时荧光PCR方法。该方法特异性好,对WSSV和IHHNV的检测敏感性分别达到2和20个模板拷贝数;此外抗干扰能力强,对WSSV和IHHNV不同模板浓度进行组合,仍可有效地同时检测这二个病毒。对保存的30份经常规PCR检测仅为WSSV或IHHNV阳性的样品进行二重实时荧光PCR检测,结果都为阳性,其中1份为WSSV和IHHNV混合感染。本研究建立的二重实时荧光PCR方法用于WSSV和IHHNV的检测具有特异、敏感、快速、定量等优点。  相似文献   
5.
构建H9N2亚型禽流感病毒M2蛋白胞外区(M2e)和HA蛋白颈部区(HA2)串联体,并在原核系统中进行该重组蛋白的表达,以便研究重组蛋白的反应原性。以含有全长H9N2亚型AIV HA基因的质粒为模板,经过PCR扩增得到HA2基因;利用BglⅡ和Bam HⅠ互为同尾酶的链接方法,构建3个拷贝M2e和HA2基因的串联体,并将串联体连接入原核表达载体pGEX-4T-1构成3M2e+HA2-pGEX重组质粒;同时构建单独表达HA2蛋白的原核表达重组质粒HA2-pGEX;DNA测序鉴定这两种重组质粒正确后,转化至表达宿主菌中;重组蛋白经不同IPTG浓度进行诱导;SDS-PAGE电泳鉴定重组蛋白大小,并进行可溶性分析和纯化;采用Western blotting法对两种重组蛋白的反应原性进行分析。结果显示,3M2e+HA2-pGEX和HA2-pGEX重组蛋白分别经终浓度为0.5 mmol/L和0.25 mmol/L的IPTG诱导,37℃培养4 h时,表达量最高;3M2e+HA2-pGEX和HA2-pGEX重组蛋白大小分别为59.4 ku和49.8 ku;对重组蛋白进行可溶性分析显示,两种重组蛋白均以包涵体形式存在;Western blotting分析显示,3M2e+HA2-pGEX和HA2-pGEX重组蛋白与免疫H9N2禽流感病毒后获得的阳性血清具有良好的特异性反应,这些结果为进一步研究HA2、3M2e+HA2蛋白的免疫原性和开发广谱H9N2亚型禽流感疫苗提供了理论依据。  相似文献   
6.
为了建立一种能够同时鉴别H5、H7、H9亚型禽流感、新城疫、传染性支气管炎和传染性喉气管炎6种鸡病毒性呼吸道传染病病原体的GeXP检测方法,本研究根据这些病原体各自的基因保守序列,设计合成了7对特异性引物,优化反应条件,用单一病毒、混合病毒样品来验证所建立的GeXP方法的特异性和准确性,以不同拷贝数的克隆质粒来检测GeXP方法的灵敏度。检测34份临床阳性样品,进一步验证该法的可靠性。结果显示,在7对引物同时存在的GeXP反应体系中,可特异性地扩增出相关6种病毒目的片段,并可在102拷贝/μL水平同时特异地检测出鸡6种病毒性呼吸道传染病,GeXP方法检测34份临床阳性样品结果与病毒分离一致。本研究建立的GeXP方法不仅可高通量检测6种病原体,而且具有特异性强和灵敏度高的特点,适用于临床样品混合感染的快速鉴别诊断,对这6种发病特征及临床症状相似的鸡病毒性呼吸道病的有效防控有很高的实际应用价值。  相似文献   
7.
根据基因库中派琴虫和折光马尔太虫基因序列,设计了两对特异性引物和两条用不同荧光基团标记的TaqMan探针.对反应条件和试剂浓度进行优化,建立了能够同时检测派琴虫和折光马尔太虫的二重荧光定量PCR方法.该方法对派琴虫和折光马尔太虫的检测敏感性达到40个模板拷贝数;对派琴虫和折光马尔太虫不同浓度模板进行组合,该方法仍可有效地同时检测出这二种原虫.研究建立的派琴虫和折光马尔太虫荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量和重复性好等优点,可用于临床上派琴虫和折光马尔太虫感染的检测.  相似文献   
8.
利用高通量测序获取1株抗原式为3,10∶a,r,z6的沙门氏菌(Salmonella)GX150603的全基因组序列.根据鞭毛抗原序列、致病性和抗性基因预测GX150603的血清型,利用分子生物学软件分析基因组岛和前噬菌体,并与其他菌株进行全基因组系统发育分析.经鉴定GX150603为韦太夫雷登沙门氏菌(Salmonella enteric asubsp.enterica serovar Weltevreden),并推测由于鞭毛抗原的氨基酸变异导致该菌株与H∶a血清产生了交叉反应.GX150603基因组携带148个毒力相关基因,8个耐药相关基因,27个基因组岛和3个前噬菌体.基因组岛包括沙门氏菌毒力岛SPI-1/2/3/4/5/6/9/11/13/14/19,centisome 63,CS54和3个该血清型特有的基因组岛.与7个韦太夫雷登沙门氏菌欧洲分离株比较,GX150603有4个共线性片段重排,4个共线性片段缺失和1个共线性片段存在较大差异,进化分析显示,同一血清型仍然表现出最近的亲缘关系.  相似文献   
9.
血凝素(hemagglutinin,HA)蛋白是禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的一个重要表面抗原性蛋白,在疾病诊断和防治上有重要意义。本研究为了探讨一种更为简便有效的HA重组蛋白表达途径,利用生物信息学软件,对H5N1亚型AIVHA基因编码的氨基酸序列进行分析,在分析其在大肠杆菌中的密码子偏好性、稀有密码子分布情况及有关蛋白的抗原性等重要特性后,构建了HA抗原表位重组表达质粒pET-32a(+)-HA。经测试,该重组质粒在1mmol/LIPTG诱导剂作用下诱导过夜,能在大肠杆菌Rosetta-gami B(DE3)中高效表达,并得到48.1kD大小的目的重组表达蛋白。重组蛋白用6×His-tagged protein纯化试剂盒纯化后,与福氏佐剂等量混合制备成抗原,以200μg/鸡的剂量皮下注射2月龄SPF鸡3次,采血分离血清。Western-Blot试验结果表明,该重组表达蛋白能分别与所制备的高免鸡血清及H5N1亚型AIV阳性血清发生特异性反应,在硝酸纤维素膜上出现特异性杂交带。说明本试验研究的HA抗原重组表达蛋白具有良好的免疫原性和反应原性,保留了HA蛋白的抗原活性,提示该重组蛋白在H5亚型AIV的防治技术研究中具有重要的实际应用价值。  相似文献   
10.
33K蛋白是Ⅰ群禽腺病毒(fowl adenovirus groupⅠ,FAVⅠ)的非结构蛋白,在感染的过程中起重要作用。为了构建原核表达载体pGEX-33K作为诊断抗原,本研究根据GenBank中FAVⅠ33K基因序列,设计1对特异性引物。用PCR方法扩增目的片段,将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建了重组质粒pGEX-33K。将其转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,pGEX-33K表达的分子量为36.7KD,表达产物主要以可溶性的形式存在于菌体中;最佳IPTG诱导浓度为0.75mmol/L,最佳诱导时间为4h;经Western Blot鉴定,pGEX-33K重组蛋白可与FAVⅠ阳性血清发生特异性反应,为FAVⅠ抗体ELISA鉴别诊断试剂盒的研究奠定基础。  相似文献   
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