合成支架在代谢工程中的研究进展

代谢工程作为通过引入外源合成途径或改造优化代谢网络,进行高附加值的天然代谢产物生物合成的技术,已经得到广泛应用。但随着目标合成产物的结构日渐复杂,构建多基因的从头合成途径造成宿主生物代谢失衡与中间产物对宿主细胞产生毒害作用等一系列问题发生的可能性也随之增加。为解决这些问题合成支架策略应运而生,合成支架将途径酶共定位以提高局部酶和代谢物的浓度,来增强代谢通量并限制中间产物与宿主细胞环境间的相互作用,成为生物催化和合成生物学研究的热点之一。尽管由核酸、蛋白质构成的合成支架策略已经应用于多种代谢物的异源合成,并取得了不同程度的成功,但合成支架的精确组装仍然是一项艰巨的任务。文中详细介绍了合成支架技术的研究现状,详细阐述了合成支架技术的原理和实例,并初步探讨了其应用前景。     

犬体外循环模型建立及麻醉处理

目的建立CPB实验动物模型,加强围手术期麻醉管理,探索肺功能保护方法 ,以减少术后并发症的产生。方法 20只实验犬全部用于建立实验动物模型。丙泊酚复合麻醉后,开胸;全血肝素化后,连接体外循环管道开始体外循环,微量泵入丙泊酚50～150μg/（kg·min）维持麻醉;监测麻醉诱导前（T0）、气管插管即刻（T1）、CPB前即刻（T2）、降温至32.0℃（T3）、阻断主动脉前即刻（T4）、阻断主动脉后2min（T5）、开始复温即刻（T6）、停CPB即刻（T7）及停CPB后15min（T8）9个时间结点的鼻咽温度、平均动脉压（mean arterial pressure,MAP）及心率（heart rate,HR）。结果体外循环期间各时点鼻咽温度均低于T0及T2（P〈0.05）;T1、T2及体外循环期间各时点的MAP明显低于T0（P〈0.05）,体外循环期间各时点的MAP低于T2（P〈0.05）;T4的HR明显低于T0及T2（P〈0.05）。体外循环期间各时点MAP比较无统计学意义（P〉0.05）。结论犬体外循环模型建立的成败与手术技术和麻醉管理密切相关。     

单切口和双切口联合手术对闭角型青光眼合并白内障患者视力、IOP及CCT的影响

目的:探讨单切口和双切口联合手术对闭角型青光眼合并白内障患者视力、眼压(IOP)及中央前房深度(CCT)的影响。方法:选择2013年6月至2016年6月我院收治的90例闭角型青光眼合并白内障患者,随机分为观察组和对照组,每组各45例。对照组采用单切口手术治疗,观察组采用双切口手术治疗。观察并比较两组患者治疗前后角膜内皮细胞密度、面积、最佳矫正视力、裸眼视力、IOP以及术后并发症的发生率。结果:与术前比较,两组患者术后角膜内皮细胞密度均升高,且观察组高于对照组,差异具有统计学意义(P0.05);与术前比较,两组患者术后角膜内皮细胞面积均减小,且观察组小于对照组,差异具有统计学意义(P0.05);与术前比较,两组患者术后最佳矫正视力、裸眼视力均升高,且观察组高于对照组,差异具有统计学意义(P0.05);与术前比较,两组患者术后IOP均降低,且观察组低于对照组,差异具有统计学意义(P0.05);与术前比较,两组患者术后CCT均升高,且观察组高于对照组,差异具有统计学意义(P0.05);观察组术后并发症总发生率低于对照组(P0.05)。结论:双切口手术治疗闭角型青光眼合并白内障的效果显著,能够有效改善患者视力、IOP及CCT水平,且安全性高,值得临床推广。     

大鼠Pael -R基因shRNA干扰载体的构建及功能筛选鉴定

目的:构建并筛选针对大鼠Pael -R基因的有效shRNA干扰载体并鉴定其干扰效果.方法:构建三个针对大鼠Pael-R基因的shRNA表达载体,利用脂质体转染大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞PC12,以G418筛选抗性细胞克隆并利用RT-PCR和Western Blotting鉴定Pael -R基因的表达.结果:在构建的3个干扰载体中,转染pRNA-U6/PaelR -3的细胞克隆中Pael -R表达在mRNA水平为29％,与对照组相比下降了45.3％,在蛋白质水平为32％,下降了27.3％ (P＜0.05).结论:构建了Pael -R基因的有效干扰载体pRNA-U6/PaelR -3,并得到了Pael -R基因表达下调型PC12细胞克隆,为研究Pael -R基因表达下调在帕金森病的发病机制及其治疗中的作用奠定了基础.     

利用ISSR-PCR技术分析香蕉枯萎病菌的遗传多样性

摘要:【目的】应用简单序列重复区间(inter-simple sequence repeats,ISSR)分子标记技术对全国主要香蕉产区95个香蕉枯萎病菌菌株进行ISSR分析,了解其遗传多样性,为香蕉品种的合理布局及枯萎病的防治提供理论依据。【方法】选用8条引物,对香蕉枯萎病菌进行ISSR-PCR分析,采用NTSYSpc v2. 10e软件分析其遗传结构。【结果】从33条随机引物中筛选出8条重复性好、特异性高的引物,共产生52个ISSR分子标记,其中92.3%的片段具有多态性。菌株间的Nei 遗传距离(D)为0.57－1.00,供试菌株以遗传距离为0.68阀值可以分为A、B、C、D、E、和F共6个类群,所占的比例分别为51.06%、5.20%、2.08%、39.58%、1.04%、1.04%。【结论】病原菌菌株间的遗传变异很大,差别很明显,ISSR聚类组群的划分与病原菌的寄主和小种有很明显的相关性。     

好氧反硝化菌的筛选及其脱氮除磷性质的研究

利用富集培养基, 从用生活污水驯化后的活性污泥中筛选得到一株具有好氧反硝化兼具除磷功能的细菌。通过形态学及生理生化指标鉴定其为假单胞菌属。利用此好氧反硝化菌处理模拟废水及生活废水, 通过监测总氮、无机磷及CODcr变化确定在C/N摩尔比为3:1、接种量为10%、pH 6.8、30°C条件下处理2 d, 该菌株脱氮、除磷及去除有机物的效果最佳, 活性污泥经此好氧反硝化菌强化后, 对生活废水的处理能力得到明显提升。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒三型、猪流感病毒三重RT-PCR检测方法建立及初步应用

【背景】猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪圆环病毒三型(porcine circovirus type III,PCV3)和猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)是3种影响猪只健康的重要呼吸道病原,对养猪业造成严重的经济损失,因此需要建立高效快速的检测方法,以了解3种病原在国内的流行情况。【目的】建立能同时检测PRRSV、PCV3和SIV的三重RT-PCR方法,为3种病毒的流行病学调查和疾病监控提供技术支持。【方法】针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),猪圆环病毒三型(PCV3),猪流感病毒(SIV)基因序列,分别设计3对特异性引物,扩增PRRSV M和N基因(436bp)、PCV3 Cap基因(619bp)和SIV M基因(199bp)。通过对退火温度和引物浓度优化建立三重RT-PCR检测方法,并对建立的多重检测方法进行特异性、敏感性、重复性试验验证。【结果】建立了能够同时快速检测PRRSV、PCV3、SIV的三重RT-PCR方法,而对猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)、猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)、猪圆环病毒2型(porcine circovirus type II,PCV2)、猪细小病毒2型(porcine parvovirus II,PPV2)、猪细小病毒3型(porcine parvovirus III,PPV3)和猪细环病毒1型(torque teno sus virus I,TTSuV1)等6种病原的扩增均为阴性,特异性较好。敏感性结果显示,同时检测PRRSV、PCV3、SIV这3种病原的检测下限为100copies/μL,批间与批内试验结果均一致。用该方法对黑龙江省部分地区猪场的67份临床病料进行检测,结果显示PRRSV阳性率为16.5%,PCV3阳性率为10.5%,SIV阳性率为10.5%,而且存在混合感染。【结论】该方法灵敏度高、特异性强,能够应用于临床样品检测,有效预测病原的流行情况。     

PDCoV、SADS-CoV与SVA三重RT-PCR检测方法的建立与应用

【背景】猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)、新型猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)与塞内卡病毒A型(Seneca virus A,SVA)均为猪的新发病原,严重危害养猪业的发展。猪感染这3种新发病原难以根据临床症状诊断,因此亟须建立多重RT-PCR检测方法对疑似患病猪进行快速诊断,以降低经济损失。【目的】建立能同时检测PDCoV、SADS-CoV和SVA单一或混合感染的三重RT-PCR检测方法。【方法】参考GenBank中登录的PDCoV和SADS-CoV N基因、SVA L/P1基因保守区域,设计3对特异性引物,以温度梯度PCR法确定最适退火温度(T_m);采用方阵法优化其引物浓度;构建重组质粒PMD-PDCoV、PMD-SADS-CoV和PMD-SVA作为标准品确定最小检测量(limits of detection,LOD);以猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等6种常见感染猪的病毒核酸样本为模板,确定三重RT-PCR法的特异性;以批间和批内实验验证其重复性;经检测疑似感染的临床样本并与已报道的检测方法进行比较,评估其临床应用效果。【结果】最佳退火温度为58.3℃;引物最佳浓度分别为0.5、0.25和0.25μmol/L;其敏感性高,PMD-PDCoV、PMD-SADS-CoV与PMD-SVA最低检测限分别为1、1和10copies/μL;其特异性强,仅对PDCoV、SADS-CoV和SVA有特异性条带,对其他病毒均无扩增条带;该方法重复性好,批间和批内实验检测结果均一致。经临床样本检测PDCoV、SADS-CoV和SVA的阳性率分别为65.85%、30.49%和57.32%,与已报道的检测方法一致。最后从13份PDCoV、SADS-CoV和SVA均为阳性的样品中随机选取5份样品进行测序,并做同源性及进化树分析,结果显示5份阳性病料的PCR扩增序列之间相似性较高,而且和参考序列之间也具有较高的相似性,均可达到96%以上。表明本研究建立的方法在应用于临床样品检测中具有较高的准确性和可靠性。【结论】建立了一种能够同时快速检测PDCoV、SADS-CoV和SVA的三重RT-PCR方法,为临床上检测上述3种病毒提供了技术支撑。     

基于临床手术标本的胰腺癌原位移植模型建立及评价

目的建立基于临床肿瘤标本的胰腺癌原位移植模型,开展模型的评价研究。方法将临床新鲜的胰腺癌手术标本移植到裸鼠胰腺部位,建立原位异种移植模型(PDOX),通过活体成像技术和PET/CT对肿瘤生长状况进行评价;采用STR技术分析移植瘤的来源,通过组织形态观察和免疫组化判定移植瘤的病理学特征,同时检测PDOX模型外周血中CA19-9的表达水平。结果模型建立6周后,通过活体成像观察到近红外荧光信号明显富集在肿瘤部位,通过荧光强度可以初步判断肿瘤位置和大小;使用小动物PET/CT可清晰观察到腹部18F-FDG分子探针富集区域,与预期的肿瘤位置和大小一致;安死术后,解剖分离的各个脏器组织及肿瘤组织,通过近红外荧光成像进一步确认肿瘤生长状况;STR检测证实移植瘤人源性比率为99.99%;组织形态学和免疫组化分析表明移植肿瘤生长于裸鼠胰腺;血清中CA19-9检测进一步证实了胰腺癌的发生。结论成功建立了人胰腺癌原位异种移植模型,通过小动物活体成像、PET/CT等技术对模型进行了全面评估,为胰腺癌的发病机制和治疗研究提供了良好的动物模型。     

菠萝VOZ转录因子序列特征及其对非生物胁迫的响应

为探究菠萝(Ananas comosus)维管植物锌指蛋白转录因子(VOZ)家族的序列特征及表达特征,该研究采用生物信息学的方法对菠萝VOZ转录因子家族进行序列分析,并通过qRT-PCR技术研究了NaCl、干旱和低温(4℃)等逆境处理对菠萝VOZ家族基因表达的影响。结果表明:(1)菠萝与拟南芥、水稻的VOZ转录因子家族均含有2个保守区域,且菠萝VOZ蛋白均为亲水酸性蛋白;蛋白质二级结构显示,菠萝VOZ蛋白主要结构元件为α-螺旋和无规则卷曲。(2)qRT-PCR分析显示,不同非生物胁迫下,AcoVOZ1和AcoVOZ2的表达量与对照差异显著,且NaCl、干旱、低温(4℃)、甘露醇、ABA、Eth胁迫下,AcoVOZ1和AcoVOZ2的表达量均呈显著下降趋势。研究推测,菠萝VOZ转录因子家族以负调控的方式参与菠萝抗高盐、干旱、低温(4℃)等非生物胁迫的应答反应,为进一步研究菠萝抗逆分子机制和菠萝抗逆性基因工程改良奠定了技术基础。